外泌體在神經炎症相關疾病中的研究進展
目前中樞神經系統炎性疾病（包括神經退行性疾病、自身免疫性疾病等）的發病機制尚未完全明確，但越來越多的研究開始關注外泌體在其中所產生的作用。在複雜的細胞間通信系統中，外泌體是最小的起源於核內體的膜性納米微囊泡。在正常或病理情況下，外泌體由各類細胞分泌釋放，通過傳遞各種信號分子參與調節多種信號通路，發揮細胞間信息交流作用，進而影響受體細胞的活性。
外泌體不僅運載細胞蛋白和脂質，還可以包含宿主細胞的mRNA和miRNA。外泌體的表膜存在特異性分子標記，因此可以追溯其起源細胞，進而成為某些疾病潛在的診斷分子標誌物。此外，由於擁有雙分子脂膜結構，外泌體能夠攜帶相關分子迅速通過血腦屏障。因此，在神經炎症相關疾病中，外泌體也可以成為其診斷以及治療的靶點。對神經系統中外泌體的特徵、分子機制及其與神經炎性相關疾病關係的進一步研究，有助於深化對神經系統外泌體的認識，為疾病預防和治療提供新線索。現圍繞外泌體在神經炎症相關過程中的研究進展進行綜述。
1.外泌體概述
外泌體是一種直徑為30～100nm的球形膜性囊泡，可以由不同類型細胞分泌，調節一系列細胞功能。與其他細胞微小囊泡類似，外泌體也可以轉運生物分子到不同類型的細胞，而不同細胞來源的外泌體之間的主要區別在於直徑大小以及細胞來源。與從細胞膜脫落相比，外泌體的形成稍顯複雜，它是由細胞中的核內體膜通過出芽方式進入多囊泡複合體，多囊泡複合體與細胞膜融合後排至細胞外的小囊泡。
由於起源細胞的不同，外泌體可以攜帶細胞特異性的蛋白，脂質或編碼以及非編碼RNA。如Feng等研究顯示，在大鼠心肌缺血預處理後，miR-22在骨髓間充質幹細胞來源的外泌體的表達上調；而Pinto等發現在轉染hSOD1-G93A後，神經幹細胞來源的外泌體內與抗炎相關的miR-124會顯著上調，改善小膠質細胞的激活。在外泌體表面存在一些特異性的蛋白，如四跨膜蛋白超家族（tetraspanin family）CD9、CD63、CD81和CD82。它們可以作為外泌體的標誌物。此外，參與外泌體形成的一些重要蛋白，如多囊泡核內體蛋白Alix，腫瘤特異性蛋白101，帶電多囊泡體蛋白4C以及核內體或核內體成熟相關蛋白脂筏標記蛋白和膜連蛋白（Annexin）都是外泌體的生物標誌物。
外泌體起源細胞的類型很大程度地影響外泌體所運載的蛋白或相關RNA。一項神經膠質瘤基因組學研究發現，來源於神經膠質瘤細胞的外泌體運載攜帶著包括四跨膜蛋白超家族，纖維連接蛋白，熱激蛋白，細胞骨架相關蛋白，prominin-1（CD133），basigin（CD147），B7-H3（CD276）等一系列參與防禦反應、細胞分化、細胞增殖和調節其他重要生物過程的分子。這表明，神經膠質瘤細胞來源的外泌體可能在調節腫瘤微環境中起重要作用，是一種潛在的腫瘤生物標誌物。除攜帶相關蛋白，外泌體也高度富集miRNA。在一項關於外泌體RNA的生物學篩選中發現，外泌體攜帶的RNA大部分為4～40個核苷酸長度，與miRNA的長度類似。
大量研究也顯示，外泌體攜帶的miRNA對於受體細胞是有功能的，能夠有效抑制受體細胞靶基因的表達。如被EB病毒感染的B細胞可以分泌含有編碼病毒miRNA的BHFR1和BART，從而抑制鄰近非感染樹突狀細胞中具有免疫調節功能的CXC趨化因子配體11基因。外泌體的攝取主要依靠外泌體膜上相關蛋白和脂質（如四跨膜蛋白超家族tetraspanin和磷酯酰絲氨酸）。其通過與存在於靶細胞脂膜上的互補分子相互作用而參與受體介導的內吞作用，並引起內化。但參與外泌體攝取內吞途徑的細胞有很大的區別。如外泌體大部分的內化是由肝庫普弗細胞、樹突狀細胞和腦內的小膠質細胞這類吞噬細胞通過吞噬作用完成的。而非吞噬細胞也可以依靠網格蛋白或獨立的內吞途徑來內化外泌體。Escrevente等發現卵巢癌腫瘤細胞可以通過一系列內吞途徑和相關蛋白來內化外泌體。
2.中樞神經系統與外泌體
中樞神經系統中絕大部分細胞，如神經元、小膠質細胞、星形膠質細胞、少突膠質細胞都分泌外泌體。這些細胞在正常條件或病理狀態下分泌的胞外囊泡可以從人體腦組織中和腦脊液中分離得到。在中樞神經系統中，神經細胞分泌的外泌體同樣扮演著清除細胞內殘片，傳遞神經細胞間信號的角色。因此，對於中樞神經系統的發育以及突觸活性調節和神經損傷再生等方面外泌體也發揮著重要作用。成熟的神經元通過影響源於少突膠質細胞的抑制性外泌體的釋放來調節少突膠質細胞的分化。
此外，為應答穀氨酸激活，少突膠質細胞可以分泌外泌體影響神經細胞的代謝，並通過少突膠質細胞的功能轉移來實現神經保護作用。突觸是神經元之間在功能上發生聯繫的部位，也是信息傳遞的關鍵部位。而不同神經細胞分泌的外泌體也通過傳遞重要蛋白參與突觸興奮這一過程。如膠質細胞在應激條件下分泌的外泌體包含一種叫突觸素的蛋白，它是與神經發育有關的突觸小泡相關蛋白。而源於小膠質細胞外泌體也可以提高受體神經元內神經酰胺和鞘氨醇的代謝，從而引起神經遞質的增多。在某些不良環境下，這些神經細胞分泌的外泌體可以維持神經元存活，促進神經突起生長。外泌體同樣也能參與神經保護的調節。一般而言，星形膠質細胞可以為神經元提高營養支持。在組織損傷情況下，為了提高鄰近神經元存活，星形膠質細胞針對氧化應激會分泌更多富含熱激蛋白70的外泌體。而在外周神經系統，神經損傷引起RhoA蛋白活性增加，這種蛋白會抑制軸突的再生，施萬細胞產生的外泌體在一定程度上可以抑制RhoA活性，從而起到神經保護作用。
3.中樞神經系統疾病與外泌體
正常大腦功能運轉離不開外泌體，而在許多神經炎症的病理過程中也涉及外泌體。越來越多的證據顯示，在一些神經炎症反應的初期，由鄰近細胞分泌的外泌體就會攜帶一些錯誤摺疊蛋白或致病性蛋白，啟動或者擴散炎症反應。除運轉蛋白，外泌體還可以特異性地轉運攜帶miRNA進入神經細胞，造成受體細胞基因表達失調。相關的研究總結如下。
3.1阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）與外泌體
AD是一種常見的與年齡相關的神經退行性病變。它主要的病理特徵是腦中胞外β澱粉樣蛋白（amyloid β，Aβ）聚集形成的澱粉樣斑塊和胞內高度磷酸化tau蛋白聚集成的神經纖維纏結。神經細胞內的Aβ被外泌體運載傳播到鄰近細胞或遠處細胞，進而造成Aβ在胞外大量聚集形成澱粉樣斑塊。同樣，tau蛋白的傳播也離不開外泌體。研究顯示，在早期AD患者的腦脊液中就能檢測到高水平表達的外泌體相關tau蛋白。小膠質細胞可以吞噬並內化含有tau蛋白的神經元，並通過外泌體分泌tau蛋白向其他細胞轉播或腦內各區域擴散。
現有的與外泌體相關的防治AD的診斷治療靶點有多種。Goetzl等選取了12例AD患者和16例額顳葉痴呆患者同28名正常人進行橫斷面對比，結果發現，與正常人相比，AD和額顳葉痴呆患者源於神經細胞外泌體的突觸小泡蛋白、突觸足蛋白、突觸結合蛋白相關基因2和神經顆粒蛋白會明顯降低；而生長相關蛋白43與突觸素1只在AD患者中降低。這一發現顯示神經細胞外泌體突觸蛋白在老年性痴呆中可能是有用的前臨床指標和進展指標。而Gui等篩選AD患者和帕金森病（Parkinson's disease，PD）患者腦脊液中差異性表達的外泌體miRNA，並通過生物信息學技術找到了一些未來可能成為AD或PD防治新靶點的外泌體miRNA及其靶基因。
3.2PD與外泌體
PD是僅次於AD的第二大神經退行性疾病。它的主要病理改變是中腦黑質多巴胺能神經元的變性死亡，由此而引起紋狀體多巴胺顯著減少而致病，臨床上主要表現為靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢步態障礙。目前，一種突出前神經蛋白———核突觸蛋白（α-synuclein，α-Syn）在細胞內增多被認為與PD病理改變相關。與AD相似，外泌體也被證明可以攜帶α-Syn到胞外環境並將有毒的低聚物轉播給鄰近神經細胞。有關研究顯示，攝取運載有α-Syn的外泌體可誘導健康神經元死亡；除了神經元，星形膠質細胞也可以將病理神經元釋放的α-Syn內化，這一現象與星形膠質細胞過度攝取α-Syn形成包涵體有關，也會進一步加重PD患者的腦內炎症反應。
除了α-Syn，富亮氨酸受體激酶2（leucine-rich receptor kinase 2，LRRK2）也逐漸得到更多的關注。現有研究發現，PD患者前額葉皮質中LRRK2蛋白水平明顯高於正常對照組，而且其LRRK2蛋白的總量也與疾病的進程相關。有學者證實，人類體腦脊液和尿液中也找到了運載LRRK2的外泌體，這可能為進一步診斷PD提供新的方向和思路。
3.3外泌體與其他神經系統疾病
與AD和PD這兩類神經退行性疾病不同，朊病毒病是一種具有傳染性的神經退行性疾病。異常的朊病毒蛋白PrPsc是一種可以通過外泌體播散的傳染性顆粒，它可造成腦組織大量海綿狀空泡形成，導致神經元死亡。Fevrier等研究證實運載PrPsc蛋白的外泌體不僅可以感染神經細胞，還可以感染非神經細胞。而Bellingham等更進一步發現，被朊病毒感染的神經細胞分泌的外泌體中一些miRNA表達會有差異性變化，而這些外泌體miRNA與一些神經系統疾病相關，如miRs-29b、128a和146a等。無論是運載PrPsc還是差異性表達的miRNA都表明外泌體在朊病毒病的發病過程中發揮重要作用。除了慢性神經退行性病變，外泌體也參與一些急性腦炎症反應的病理生理過程。
創傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）在早期以急性腦損傷為主，後期則表現為一些慢性神經退行性疾病的症狀，如運動、認知能力受損、伴隨有焦慮、情緒情感行為變化。但在這兩個階段過程中，神經炎症反應都發揮重要作用。急性損傷期的神經炎症反應如果持續存在不僅會引起瀰漫性軸索損傷、腦組織腫脹、神經細胞大量死亡，還會導致後期神經功能進行性減退、神經細胞延遲死亡。因此，如何減輕TBI急性神經炎症反應成為目前治療TBI的一個熱議話題。目前由間充質幹細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）分泌的外泌體成為研究的熱點。MCSs是一類擁有自我更新、分化潛能的多功能細胞。常被用於研究一些非再生組織，如神經組織的細胞替代治療。
但MSCs調節組織再生的主要機制並不是細胞移植，而是基於蛋白組學的旁分泌途徑，而源於MSCs的外泌體就是其中一類有生物活性的分泌因子。與其他類型細胞相比，MSCs能大量分泌外泌體，而且其外泌體的形態、功能及分離儲存條件也沒有很大區別。與其他類型細胞分泌的外泌體相同，MSCs分泌的外泌體也可裝載不同的蛋白和miRNA，從而參與細胞間的信號交換和受體細胞的週期調控。但在不同環境下，源於MSCs的外泌體所攜帶的信號分子會不同。如在大鼠腦中動脈栓塞模型中，與對照組相比，模型組腦組織中MSCs分泌的攜帶miR-133b的外泌體會明顯增加；另一項研究也顯示，將小鼠骨髓MSCs進行缺血預處理，其分泌的攜帶miR-22外泌體會明顯增加，而這些攜帶miR-22的外泌體可以通過靶向調節Mecp2蛋白抑制心肌細胞凋亡，減輕心肌纖維化。
在TBI治療方面，Zhang等首次將MSCs分泌的外泌體靜脈注入TBI大鼠體內，觀察發現MSCs分泌的外泌體可以減輕TBI大鼠腦內星形膠質細胞和小膠質細胞的激活，抑制炎症反應，促進神經功能恢復。由於MSCs分泌的外泌體具有納米尺度、低免疫性、高效通過血腦屏障、有效運輸生物活性分子等特點，未來很有可能成為TBI神經炎症反應治療的新靶點。但其具體的細胞和分子機制仍需要進一步探索。
神經炎性疾病治療過程中的一個重要障礙是沒有有效的載體將藥物轉運通過血腦屏障。而外泌體因具有低免疫性、先天穩定性、高遞送效率和穿過血腦屏障等特點，可以成為神經炎性疾病理想的藥物運載工具。Sun等首次將具有抗炎效應的薑黃素包裹在外泌體中用於干預活化的髓樣細胞和治療脂多糖誘導的膿毒症大鼠模型。結果顯示，將薑黃素包裹進外泌體可以增加薑黃素的溶解度、穩定性和生物可利用度；而與單獨使用薑黃素和脂質體包裹薑黃素相比，外泌體包裹的薑黃素更能抑制活化的單核巨噬細胞產生的炎性因子並減輕脂多糖誘導的膿毒症大鼠的肺損傷。
基於這些發現，Zhang等繼續利用外泌體包裹的薑黃素經鼻給藥干預脂多糖誘導的大鼠腦炎症反應模型和髓鞘少突膠質細胞糖蛋白誘導的大鼠實驗性自身免疫性腦炎。結果顯示，經鼻給予外泌體包裹的薑黃素也能迅速轉運至大鼠腦內，並誘導活化的小膠質細胞凋亡，延緩大鼠實驗性自身免疫性腦炎的進展。這也為神經系統炎性疾病的用藥和治療提供了一個新思路。除了運載藥物，外泌體也被用於裝載小干擾RNA靶向抑制腦內特定基因。Alvarez-Erviti等證實，樹突細胞分泌的外泌體可以轉載小干擾RNA抑制腦內神經元、小膠質細胞、少突膠質細胞中的靶基因。而Liu等則利用外泌體包裹μ受體小干擾RNA技術通過抑制小鼠腦內μ受體mRNA和蛋白水平改善小鼠嗎啡成癮的症狀。
但想要將外泌體真正投入臨床使用仍有一些問題需要解決：①進一步提高靶向運送的特異性；②為了確定給藥的頻率，需要了解藥物包裹在外泌體的生物利用度和半衰期；③外泌體給藥的位點的選擇；④需要了解外泌體藥物對於非靶點效應的潛在毒性。
5.小結
近年來，有關外泌體生物起源、生物功能和生物特性的研究越來越多。外泌體是一種擁有多重生物功能的活性載體，在中樞神經系統炎性疾病診斷治療的相關研究才剛剛起步。考慮到外泌體在細胞間物質運輸和信號傳遞的重要特點，相信還會有更多的研究關注不同的信號分子通過外泌體在疾病演變過程中所起到的診斷以及治療的作用。而對外泌體作為生物標誌物和未來治療靶點的研究也會為進一步理解神經系統炎性疾病的發生、發展提供全新的視角。
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