當精子與卵細胞結合後，新生命迅速開啟一系列染色質重編程程序，從而實現自身基因組激活（受精卵基因組激活，ZGA）。近年來，隨著基因組學技術（Genomic Profiling）的廣泛應用，我們對這一胚胎早期發育過程各個階段的生物學事件有了長足的認識和理解，但受精卵如何在第一時間啟動染色質重編程仍是發育生物學領域內長久以來的未解之迷。追溯到精子發生後期，單倍體精子細胞的全基因組將逐步發生劇烈的染色質重構，與DNA結合的組蛋白幾乎全部被一種富含精氨酸的鹼性核蛋白——
魚精蛋白（Protamine）所替換（“組蛋白 - 魚精蛋白置換”），從而造成基因轉錄活動逐漸停止、基因組高度摺疊，最終使精子細胞核呈極度壓縮狀態，這一過程旨在確保精子將DNA信息安全、精確、無損地傳遞給後代。而在受精之後，合子染色質重構的首要任務便是對精子攜帶入卵細胞的父源基因組進行快速、高效的解壓縮，即用母源組蛋白替換包裹精子DNA的魚精蛋白（“魚精蛋白- 組蛋白置換”）。過去已有的研究表明，一類在卵細胞中高度表達的酸性蛋白因子nucleoplasmin（NPM2）在這一過程中參與將魚精蛋白由父源染色質中移除【1-6】；同時，另一種母源組蛋白伴侶因子HIRA負責將組蛋白H3.3裝配到父源DNA上【7-9】。但是，受精卵如何快速高效地啟動父源染色質的“魚精蛋白- 組蛋白置換”，在領域內一直鮮為人知。魚精蛋白是一類由組蛋白進化而來的富含精氨酸的小核蛋白，相對於常規組蛋白，魚精蛋白帶有更強的正電荷，因此其與DNA具有更強的結合能力。有趣的是，哺乳動物魚精蛋白具有多個潛在的磷酸化修飾位點，且早年間的生化研究表明，多種激酶均能在體外條件下磷酸化修飾魚精蛋白
【10-12】。但是，魚精蛋白的磷酸化修飾具有何種生物學功能？這種修飾在體內是否可能成為調控魚精蛋白與DNA親和力的一種主要方式？如果是，在體內究竟由何種激酶來負責催化魚精蛋白？如果仔細對魚精蛋白的蛋白質序列進行觀察分析，不難發現哺乳動物魚精蛋白具有若干個潛在且保守的絲氨酸（Ser, S）磷酸化位點，且每一個絲氨酸均與相鄰的精氨酸（Arg, R）構成 “Ser/Arg二肽”。有趣的是，這種特異的二肽也普遍存在於負責RNA剪接的SR蛋白中，且這類二肽序列特徵能夠被SR蛋白特異性剪接激酶SRPK所識別並進行磷酸化修飾。美國加州大學聖地亞哥分校細胞與分子醫學系付向東教授實驗室於上世紀九十年代發現了剪接因子SR蛋白特異性的激酶家族（SRPK）【13-14】，並長期致力於SRPK激酶在pre-mRNA剪接過程中的功能機制研究，其一系列開創性工作均已成為當前SRPK激酶研究的關鍵文獻資料。在本研究的前期工作中，付向東實驗室苟蘭濤博士發現雌性小鼠MII 卵細胞中富含大量的SRPK1蛋白，且體外磷酸化實驗證明SRPK1激酶可高效催化化學合成的小鼠魚精蛋白1 （Protamine 1, P1），提示卵細胞內廣泛分佈的母源SRPK1激酶可能通過催化進入卵細胞內的精子染色質中的魚精蛋白來調控啟動受精卵早期染色質重構。
2020年3月12日，付向東實驗室在Cell上發表文章 Initiation of Parental Genome Reprogramming in Fertilized Oocyte by Splicing Kinase SRPK1-Catalyzed Protamine Phosphorylation ，首次報道了SR蛋白特異性剪接激酶SRPK1在小鼠受精卵早期發育過程中具有重要功能：即母源SRPK1激酶負責催化進入卵細胞的精子DNA快速起始解壓縮，協助啟動受精卵早期染色質重構，從而保障雄原核與雌原核逐步發育形成並隨後融合。
為了探究卵細胞內的母源SRPK1究竟是否在受精卵及早期胚胎髮育中發揮重要生物學功能，該研究作者首先利用SRPK1特異性抑制劑【15】處理小鼠超排的MII卵細胞，發現該抑制劑處理不會造成卵細胞體外受精率的顯著改變，但可導致部分受精卵發育阻滯停留在1細胞期。隨後，作者進一步通過 SRPK1敲除小鼠模型證實該激酶的確在受精卵發育過程中扮演重要角色，且喪失SRPK1激酶很可能直接造成受精卵雄原核發育異常。為了直接證明SRPK1激酶的催化活性為受精卵發育所必需，作者又利用小鼠卵細胞顯微注射及體外培養技術【7, 16】，通過注射特異性siRNA將母源SRPK1敲低。這項實驗進一步發現該激酶在受精卵內的缺失將造成精子染色質解壓縮失敗，雄原核發育停滯。有趣的是，如果在卵細胞顯微操作時同時注入人源SRPK1 mRNA （拮抗siRNA作用），則受精卵及雄原核發育缺陷可被有效拯救恢復；而喪失激酶催化活性的人源SRPK1 mRNA (KD) 則沒有拯救效果。因此，作者先後利用化學抑制劑處理、遺傳學敲除、以及顯微注射敲低與mRNA拯救這三種不同的實驗策略，充分證明了母源SRPK1激酶的催化活性在受精卵父源染色質解壓縮及重構過程中發揮重要功能。
隨後，為了繼續研究母源SRPK1激酶的作用途徑和底物，作者製備並純化了一系列魚精蛋白磷酸化抗體，並進而證實了SRPK1激酶高效、迅速地催化受精後進入卵細胞的精子染色質，使其中的魚精蛋白被磷酸化修飾。且體外、體內實驗證據均表明魚精蛋白1（P1）具有兩個磷酸化修飾位點，分別位於其蛋白N端（Ser9）與C端（Ser 43）。接下來，為了進一步探究母源SRPK1是否通過催化魚精蛋白磷酸化修飾而直接影響受精卵父源染色質解壓縮，作者利用CRISPR/Cas9技術構建了魚精蛋白1的knock-in小鼠，分別對其磷酸化位點Ser9與Ser43進行突變，產生三株特異的knock-in小鼠模型P1S9A、P1S43A、及 P1S9S43A。值得注意的是，單一磷酸化位點突變的精子（P1S9A、P1S43A）在進入卵細胞後仍可被正常解壓縮併發生染色質重構，而不影響雄原核生成和受精卵發育；但磷酸化位點雙突變的精子（P1S9S43A）雖然仍具有精子活性和功能，但其進入卵細胞後不能被有效解壓縮，導致隨後雄原核發育停滯。
那麼，SRPK1介導的魚精蛋白磷酸化修飾是如何啟動父源染色質解壓縮重構的呢？為了探究這一機制，作者利用體外實驗系統研究並發現，化學合成的魚精蛋白能夠與雙鏈DNA分子在體外迅速地發生相變分離（Phase transition），形成膠狀顆粒（gel-like particle），並逐漸形成緻密的交聯網絡。如果把這一過程簡單地理解為精子發生過程中魚精蛋白對基因組DNA的壓縮排列，那麼魚精蛋白的磷酸化修飾會對其造成何種改變和影響呢？體外實驗表明，SRPK1處理可“融化”緻密排列的交聯網絡，逆轉魚精蛋白與DNA形成的高維結構。進一步，作者用體外純化的SRPK1激酶處理小鼠精子， 發現經過處理的小鼠精子能夠更加高效地被NPM2作用並快速喪失魚精蛋白。同時，作者還發現，魚精蛋白磷酸化能夠負責招募組蛋白伴侶HIRA富集於受精卵父源染色質並介導H3.3的裝配。對上述實驗現象的機制研究發現，魚精蛋白磷酸化修飾後其與NPM2及HIRA的親合力大大增強。因此，作者認為當精子染色質中的魚精蛋白被磷酸化修飾後，
其一方面協助打開染色質結構，同時促進招募NPM2與HIRA蛋白因子，協同負責染色質中魚精蛋白的剔除與組蛋白H3.3的裝配，最終實現高效“魚精蛋白- 組蛋白置換”。最後，作者進一步使用染色質開放性檢測技術（ATAC-seq）調查受精後父源及母源染色質重構的進程。他們分別採用C57BL/6品系小鼠的精子與BALB/cJ品系小鼠的卵細胞進行體外受精，對處於早期發育階段（PN2-PN3）的受精卵基因組中的開放區域進行檢測記錄，隨後利用兩種不同品系小鼠基因組中的SNP差異【17】進行後期數據拆分，即分別獲得父源及母源染色質重構信息。與之前發現一致，與P1S9A及P1S43A單突變精子形成的受精卵，其早期父源、母源染色質開放區域均與野生型無異；而P1S9S43A雙突變父源染色質基本完全繼承保留了精子中的染色質開放狀態。令人意外的是， P1S9S43A雙突變父源染色質重構的停滯還造成了其母源染色質開放狀態的異常，其完全保留了MII卵細胞的染色質開放區域，並未觀察到其進行了明顯的染色質重構。這一結果不但從全基因組角度再次證明SRPK1介導的魚精蛋白磷酸化對受精卵染色質重構起到重要起始調控作用，還進一步表明受精卵中父源及母源染色質的發育重構是相互協調和影響的。
圖1. 受精卵父源染色質解壓縮及重構機制示意圖
當前這項研究工作發現受精後母源SRPK1催化父源基因組魚精蛋白磷酸化並啟動染色質重構，不僅為解析早期受精卵染色質發育事件提供了新線索，還將有助於後期精子細胞染色質重構的深入研究，併為相關人類不育症的診斷治療提供理論參考依據和靶點。
該項研究工作由美國加州大學聖地亞哥分校細胞與分子醫學系付向東實驗室完成，加州大學聖地亞哥分校苟蘭濤博士、Do-Hwan Lim博士、馬武彬博士為該研究論文的共同第一作者。此項研究同時得到了中國科學院分子細胞科學卓越創新中心（中科院生化細胞所）劉默芳研究員、加州大學聖地亞哥分校Joseph Adams教授、Pamela Mellon 教授、Michael Rosenfeld教授、中國科學院分子細胞科學卓越創新中心（中科院生化細胞所）李黨生研究員、中國科學院生物物理研究所許瑞明研究員等的大力協助。
原文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.020
製版人：珂
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