结核分枝杆菌临床检验与进展

作者：深圳市第三人民医院（南方科技大学第二附属医院）/国家感染性疾病临床医学研究中心 马爱静 杨梁梓 傅佳鹏 刘志超 钱莘 李国保

据世界卫生组织（WHO）估计，2019年全球估计有1000万人感染结核病（Tuberculosis, TB），约有120万人死于结核病[1]。我国是全球22个结核病高负担国家之一，结核患者数量居世界第二位[1]。

近年来，随着现代结核病控制策略的广泛实施，我国结核病控制工作取得巨大成绩。然而，由于耐药结核病的存在以及我国人口密度密集，许多结核分枝杆菌感染者并没有获得足够的初步诊断，日益成为我国乃至全球结核病控制的一大难题。

为解决这个问题，国内外不断研究新的诊断检验方法，以期快速准确地诊断结核病。本文对结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）快速诊断相关的当前技术以及潜在的新兴技术进行阐述，并对诊断新技术的发展及应用前景进行展望。

一、传统检测技术

抗酸杆菌（AFB）痰涂片染色镜检（SSM）是世界范围内结核病检查中使用最广泛的技术，并被WHO推荐在发展中国家的结核病控制中使用，是全程督导化学治疗（DOTS）策略的基础。SSM成本低廉，且对生物安全的要求最低。尽管不能区分死菌和活菌，不能确定药物敏感性，不能区分结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌，且检测敏感度不高［特别是对于人类免疫缺陷病毒（HIV）携带者和儿童而言］，在一些资源缺乏的国家，例如南非，痰涂片镜检已替换Xpert MTB/ RIF作为肺结核初始诊断测试[2]。

此外，近几年来，以实验室为基础的结核诊断也取得了显著的进步。荧光二极管（LED）显微镜对比传统的萋尼氏染色镜检（Ziehl-Neelsen acid-fast staining，ZN）具有更高的敏感性，而且能进一步定性，具有操作和成本优势。在2009年，WHO推荐LED显微镜镜检替代Z-N镜检[3]。金胺O-罗丹明染色（Auramine O-Rhodamine fluorescent staining，AO or AR）是使用荧光显微镜观察抗酸杆菌（包括分枝杆菌）的组织学技术。这种技术被认为是优于萋-尼氏抗酸染色的方法[4, 5]。

二、基于细菌培养的检测方法

培养方法是MTB检测的金标准，罗氏培养法、BD BACTEC™分枝杆菌生长指示管法是最常用的MTB检测方法。前者检测周期耗时较长，大约需要4周左右，且检测灵敏度较低；后者是一种非放射性、基于荧光的手动或自动化系统，可用于从各种临床标本中快速检测分枝杆菌，该配备的培养基、营养添加剂、杂菌抑制剂价格高昂，不利于基层开展[5]。

基于药敏试验的培养方法是目前准确检测二线药物耐药情况的唯一可用方法。但是需要数周才能获得结果，且对实验室的装备和人员有较高要求，还需要一个有效的运输系统，以确保痰标本的活性。尽管现在已有快速的商业化的液体培养系统可供使用，但由于花费及基础设施方面的要求，在很多结核病高负担国家建立具有足够结核分枝杆菌培养能力的实验室，进程进展缓慢。

多年来，一些非商业化的更为快速和廉价的培养以及药物敏感性试验（DST）方法被开发出来，其中包括显微观察药物敏感性检测技术（microscopic observation drug susceptibility，MODS）、薄层琼脂法（Thin-layer agar，TLA）、硝酸还原酶法（nitrate reductase assay, NRA）和比色氧化还原指示剂（colorimetric redox-indicator，CRI）等[6]。

三、免疫学检测方法

相对于SSM，MTB特定生物标记物的检测技术可能给MTB感染提供了一个更低成本和更快速有效的筛选工具。

1. 结核菌素皮试试验（Tuberculin Skin Test, TST）应用结核菌素对机体进行测定，观察人体能否被引发皮肤迟发超敏反应，以此来判断人体对于结核分枝杆菌有无免疫力，进而判断受试者是否曾经感染过结核分枝杆菌。然而，对于已经接种卡介苗（BCG）的人而言，TST试验会显示一种假阳性结果；对于免疫功能不全的人则会显示一种假阴性的结果[5, 7]。

2. γ- 干扰素释放试验（interferon-γ release assay，IGRA）是指通过检测患者全血或分离自全血的单核细胞在 MTB 特异性抗原刺激下产生的γ-干扰素，判断受试者是否感染MTB的检测方法[5]。但在实际使用中发现，IGRA在不同地区、不同人群中的特异度和敏感度均存在较大差异。此外，不同IGRA产品使用的抗原、检测试剂、检测参数和界值设定等可能存在差异，对最终检测结果及其判读有一定影响，且无法区分活动性结核病与潜伏性结核感染[5, 8]。

3. 脂阿拉伯甘露糖（LAM）检测可以提高HIV感染后期患者对TB可疑性的鉴定。2013年，Alere Determine™ TB LAM Ag 横向流动试纸检测成为第一个用于HIV合并感染结核病患者床边尿检的商用诊断方法，该方法只需要60 µl的尿液即可在25分钟之内提供结果[5]。目前，尿液LAM检测的准确性研究成为主要研究方向。该方法检测的患者群体具有多样性，包括肺外结核病患者、无法主动提供痰液的肺结核患者及住院患者等。因此，LAM检测相较于痰涂片镜检以及结核分枝杆菌及利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测（Xpert MTB/RIF）的递增价值不断改变[9]。

4. 挥发性有机化合物（Volatile organic chemicals，VOCs）以及结核分枝杆菌其他特异的分子标记物可在5分钟内自动排除结核感染。最近，作为潜在结核病诊断目标的一些挥发性有机化合物，通过训练过的袋鼠对人体痰标本的气味检测进行了验证。这些挥发性有机化合物来自结核分枝杆菌的代谢以及人体组织损伤。分析仪器灵敏度的提高促进了该方法的进步[10]。

此外，结核病血液检测可以衡量患者免疫系统对结核分枝杆菌抵抗的强弱。酶联免疫吸附试验 （ELISA）、免疫斑点技术（DIGFA）、免疫胶体金技术、蛋白芯片技术等亦为针对结核分枝杆菌抗原抗体进行检测的免疫学诊断方法。

四、分子检测方法

用核酸扩增试验（NAAT）对结核进行分子诊断，快速且具有高度特异性，并能预测结核分枝杆菌的耐药性。

1. 环介导等温扩增技术（LAMP）

LAMP技术在恒温条件下对目标基因进行扩增，具有特异性高、效率高、速度快的特点，是传统的NAAT的替代。与超快速提取试剂盒（PURE-TB-LAMP）来协同提取痰液标本结核分枝杆菌的DNA，并消除抑制性物质，加强了对原痰液标本中结核分枝杆菌快速检测的灵敏性和特异性，并提高了生物安全的措施[11]。

2016年8月11日，WHO在日内瓦发布了一份最新的推荐书，推荐TB-LAMP法（环介导等温扩增，loop-mediated isothermal amplification）为发展中国家的基础医疗单位，例如社区医院等地方使用的新的结核病检测方法。这种方法经过评估，可以作为痰涂片检测方法的替代方案。该检测方式对实验室基础设施、设备的要求较少[12]。然而， TB-LAMP对于涂片阴性的样本的检测灵敏性有局限性，对于交叉污染、假阳性结果、TB-LAMP结果的用户依赖性以及需要全面的培训和质量保证存在可能的风险性[13]。且TB-LAMP法无法检测出患者的耐药性，因此这种检测方法仅适用于非多耐药结核患者（MDR-TB）。

2. 结核分枝杆菌及利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测（Xpert MTB/RIF）

Xpert MTB/RIF作为一个完全自动化的集成NAAT平台，包括样品制备、扩增和DNA检测，是目前对于结核分枝杆菌最先进的工具。Xpert MTB/RIF可以针对很多现有的商业化的NAAT方法所具有的局限性进行处理，例如交叉污染、时间消耗以及实验室问题等。Xpert MTB/RIF检测是在一个封闭的系统中进行扩增，在2小时内可同时确认结核分枝杆菌的存在以及利福平抗性突变[14]。与所有的NAAT试验类似，Xpert MTB/RIF检测方法的敏感性不如培养方法，但是比涂片镜检敏感，提高了结核病患者的细菌学确诊比例。

3. 结核分枝杆菌线性探针耐药检测技术（LPA）

除了Xpert MTB/RIF，LPA是WHO认可的从痰涂片阳性标本或者结核分枝杆菌菌株中快速诊断TB和MDR-TB的分子试验[15]。GenoType MTBDRplus LPA是市售可获得的用于检测对一线药物如利福平和异烟肼抗性的方法，以及它的下一代GenoType MTBDRsl，可以检测对二线药物例如氟喹诺酮类、氨基糖甙类、环肽、乙胺丁醇和链霉素的抗性。

线性探针可以通过DNA杂交技术在2天内从临床标本中检测赋予临床样品抗生素耐药性的基因突变。目前，LPA不止可用来快速检测涂片阳性的标本，同时可用来检测抗酸杆菌（AFB）涂片阴性而PCR结果阳性的耐药结核杆菌（DR-TB）[16]。尽管线性探针目前已经被很多国家所采用，作为传统DST的替代，专家组建议，GenoType MTBDRsl LPA不能用于广泛耐药结核病的检测，因为尽管其对二线药物抗性检测具有高特异性，但是灵敏度较低[15, 17]。此外，LPA一般非常昂贵，需要复杂的实验室基础设施，因此其在低收入、高负担的国家的作用和实用价值将需要实地进行评估。

4. 基因芯片耐多药检测方法

该方法是一种可以快速检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性的分子生物学方法[18]。与传统的细菌学药敏实验相比，完成整个检测仅需要6 h，方便快速。人类尿液中含有一些濒死的体细胞或者微生物中大约300碱基对的细胞自由片段称为Transrenal DNA。这些片段是传染病诊断目标，因为至少在理论上，可以无需侵入受感染的身体组织而将它们扩增。然而在几个比较小的实践研究中，检测尿液中的结核分枝杆菌衍生的Transrenal DNA的灵敏度相差很大[19]。

结核病的诊断是结核病防治的关键，现有或新出现的技术在分析前诊断肺结核可以通过优化样本采集或通过更好地保存样品的完整性提供渐进式改进。这些方法可以与现有的一些技术（SSM, NAAT或培养）协同以提供更好的诊断结果。同样，自动显微镜系统可以通过改善工作量、效率或资源需求（熟练的工作人员和质量保证）等方式迎接挑战，提高诊断率。基于NAAT的检测方法的途径是传染源诊断技术的核心，在不同水平的实验室中都具有不断发展的空间与前景。线性探针的范围很大，一些具体的方法可以提供特异的结核诊断以及药物敏感性测试。芯片技术可通过降低测试的复杂性提供更大等位基因变异的筛选。这些技术目前面临的挑战是对于其用途性能充分的证据。然而，许多技术还缺乏足够的验证，以提供其对于提高结核诊断的真正的性能以及潜力。检测样本、检测因子等单一化，程序复杂，成本高昂，不适用于大规模推广普及。因此，今后的工作尚需寻找新的检测靶标，发展新的诊断方法，研发新的诊断试剂。

作者简介

李国保，主任医师、教授；南方科技大学第二附属医院肺病医学部副主任、肺病三科主任。

长期在临床一线工作，从事呼吸、结核病、危重症临床救治工作。在危重结核病、气管镜及机械通气的临床应用、耐药肺结核并呼吸衰竭救治、结核性毁损肺的肺保护性机械通气、危重患者评估、院内获得性感染等临床和研究方面，取得了一定的成绩。在呼吸系统危重疾病及突发公共卫生事件救治方面有较为丰富的临床经验。其在2007年创立的呼吸、危重症学科为深圳市突发公共卫生事件如H1N1、H7N9及本单位呼吸危重疾病救治做出了应有的贡献并积累了较为丰富的临床经验。荣获省级科技成果奖3项，市级科技成果奖4项，市科技进步奖3项。近年来完成了“十一五”国家重大专项2项，“十二五”国家重大专项1项， “十三五”国家重大专项1项。深圳市科研立项1项。

社会任职：中华医学会结核病学分会委员、重症专业委员会主任委员；中国医药教育协会感染疾病专业委员会委员；广东省医学会结核病学分会副主任委员；广东省药学会呼吸用药委员会委员，深圳市医学会结核病专委会主任委员、呼吸专业委员会常务委员；深圳市医师协会结核病专委会主任委员。深圳市突发公共卫生事件医疗救治专家组专家。

马爱静，女，医学博士，出生年月1990.03，从事结核分枝杆菌与常见非结核分枝杆菌快速诊断及药物敏感性研究。

参考文献

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