新型SARS-CoV-2检测方法—成本更低、灵敏度至1个RNA copy/μL

撰文 | Leon

责编 | 雪月

在当前疫情的大流行下,SARS-CoV-2检测和诊断的需求是空前的,全世界的科学家正在努力开发各种各样的检测方法。理想的检测方法应该不需要专门的设备,在不同的环境下都可以进行应用。而且,还应该在短时间内得到结果,结果易于解读。

2020年4月28日,哈佛医学院的Constance Cepko实验室在medRxiv预印本服务器发布了他们开发的基于RT-LAMP(reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification)的新型SARS-CoV-2检测方法。只需常用的试剂和65度温浴,不需要PCR仪,检测结果会在30分钟内以比色的形式呈现,每个样本的成本仅为7美分(约人民币5角)这项方法还可以检测唾液中的SARS-CoV-2。更重要的是,该方法的灵敏度很高,检测下限为每微升1个RNA拷贝。

新型SARS-CoV-2检测方法—成本更低、灵敏度至1个RNA copy/μL

LAMP是一种快速DNA扩增的方法,需要六种DNA oligo与目标分子的8个不同区域杂交。在一种特殊的DNA聚合酶(strand displacing polymerase)介导下,反应中形成类似于环状的DNA结构,进而进行快速的扩增反应。这种反应能够在很短的时间内,在单一的反应温度下产生微克级别的DNA[1]。此外,由于这种DNA聚合酶有反转录活性,LAMP也可以用来检测RNA(RT-LAMP),也可以加入逆转录酶以提高反应的灵敏度。LAMP反应最后会产生大量的DNA,可以通过使用DNA染料来呈现结果,也可以简单地通过溶液浊度升高,或pH的降低来反映结果[2]。其中,pH的变化足以使pH指示剂改变颜色,可以作为呈现结果的最佳方式。

在RT-LAMP反应中,每个循环为65℃,30秒。理想情况下,30分钟后(第60个循环后)可以读取结果。但为了增强显色反应,也可以延长到40分钟。作者针对SARS-CoV-2的ORF1ab设计了引物,该区域与其他密切相关的SARS-CoV并不高度保守。研究者比较了几种方法,也对设计的引物进行了优化,最后得到了与其他方法相比表现最灵敏的方法。

除了使用RT-LAMP对SARS-CoV-2进行检测外,作者还优化了样品制备,以提高灵敏度,并保证样品对实验者的安全。作者发现RT-LAMP反应对去污剂耐受,1.5% Tween 20或1%Triton X100对反应没有明显影响。RNA纯化时会加入GuSCN来抑制RNase,RT-LAMP反应对GuSCN或另一种盐NaI的耐受达到50 mM。为了快速灭活并裂解病毒颗粒,同时保护RNA,作者采用了TCEP和EDTA。

为进一步提高灵敏度,使其更便宜、更易获得、更易于规模化,作者优化出一种能够将病毒RNA浓缩的方案为了做到这一点,实验者使用了一种非常廉价的二氧化硅颗粒悬浮液。这种悬浮液是把细小的二氧化硅颗粒悬浮在水中制成的。二氧化硅颗粒悬浮液是目前常用的核酸抽提试剂盒的前身,核酸在GuSCN或NaI存在下会与离心柱中的二氧化硅薄膜结合。这样,加入了NaI和悬浮液,病毒RNA得到浓缩,RT-LAMP的检测下限进一步下降到每微升1个RNA拷贝。这种方案不需要商业试剂盒,也不需要离心机。二氧化硅颗粒悬浮液很容易获得,不需要专门的设备或昂贵的试剂,成本低。整套流程下来,每个检测样本的成本仅为7美分(约人民币5角)

新型SARS-CoV-2检测方法—成本更低、灵敏度至1个RNA copy/μL

样本灭活和纯化流程


最后,作者还想开发一种从唾液中纯化病毒RNA的方法。用上述方案使病毒失活后,在加入二氧化硅颗粒悬浮液之前,由于絮状物的存在,作者不得不使用离心机来分离出上清。尽管最后也能达到每微升1个RNA拷贝的灵敏度,但离心机的使用减少了这个方案的简便性。研究者将邀请其他团队一起合作,简化唾液检测的流程(比如使用简易的离心机)。

新型SARS-CoV-2检测方法—成本更低、灵敏度至1个RNA copy/μL

基于RT-LAMP的检测灵敏度非常高(阳性显示为黄色,阴性为红色)


原文链接

https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.04.23.20076877v1.full.pdf


参考文献

1.Nagamine, K., T. Hase, and T. Notomi, Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes, 2002. 16(3): p.223-9.

2. Calvert,A.E., et al., Rapid colorimetric detection of Zika virus from serum and urine specimens by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification(RT-LAMP). PLoS One, 2017. 12(9): p. e0185340.


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