引言
上期提到科學家們給病毒“拍照”用的不是光學顯微鏡,主要是電子顯微鏡。比如這次的新冠病毒COVID-19發佈的幾張圖片。
電子顯微技(後文稱電鏡)的原理可以概括為:電子槍發射的電子束被加速後,經電磁透鏡匯聚,打到樣品上。
一部分電子被“反彈”,一部分電子穿透樣品,這兩種電子攜帶了樣品的信息。我們用探測器採集、放大並分析這些信號就能實現對病毒的拍照。
相比光學顯微鏡,電子顯微鏡所使用的“光源”(實際是電子源)波長更短,根據阿貝方程,分辨率更高。具體可見
但是,正如女士出門曝光前都得化化妝,病毒送進電鏡前也得可勁兒捯飭,不是提取完就能拍攝的。本文將類比化妝,一步步分析病毒拍照前有哪些步驟。
固定和脫水
化妝前講究先補水,皮膚乾乾巴巴很難受,但是,給病毒化妝正相反,要基本保證生物樣品的完全乾燥,不含有任何揮發性物質。
原因是:作為“照明光”的電子束流要在接近真空的環境中才能被準確操縱。否則,“光路”上的氣體分子會散射電子,使得電子束聚焦能力下降,最終導致分辨率降低。
被散射的電子束
另外,如果含有氧化性氣體,電子槍中用於產生電子的材料(比如金屬鎢)在高溫下(2000度以上)很容易被氧化,燈絲報廢。運氣不好的話,幾十、上百kV的高壓電直接把艙室擊穿,很容易造成危險。
2700K等數據是電子槍工作時燈絲的溫度
所以,在拍攝中,整個電鏡艙室都要保持真空,包括樣品所在的環境。
另外,如果病毒樣品中含有水、乙醇等揮發性物質,在真空條件下會沸騰,沒錯,沸騰,直接變氣態。具體原理可見 ,水的體積瞬間變大可能會破壞病毒結構,導致難以分辨。
0.0075°C的水在611.73Pa下沸騰
因此,給病毒化妝中第一步就是除去水分子。
但是,液體的表面張力是維持生物樣品完整外形的重要原因,換句話說,水分子除去後,樣品可能會因為環境的改變而坍縮,同樣不利於觀測。
不脫水不是,脫水也不是,這下麻煩了。
如果突然把水抽走,固體表面會因為內應力而被破壞
就像先拍照再修圖一樣,現在的做法是,在脫水前把病毒和周圍組織的模樣都固定下來。維持冠狀病毒結構的物質主要由蛋白質外殼+脂質包膜組成,所以分別選用戊二醛+四氧化鋨進行固定。
這個過程可以類比交聯,就像拿膠把一捆捆繩子粘起來,粘後的繩子結構更穩定,原理可見
化妝要處處講究輕柔,除了使用固定劑,為了減小脫水時對樣品結構的破壞,實驗室裡經常會用乙醇逐級脫水或者丙酮脫水的手段,先把樣品中的水置換為揮發性強的溶劑。
之後,再用臨界點乾燥的方法去除這些溶劑(相比水,這些溶劑更容易被清除)。超臨界乾燥的原理解釋較為複雜,咖啡機有時候就會用到超臨界流體(supercritical fluid),感興趣的可以在評論區回覆“臨界點”,我單獨撰寫文章解釋。
總之,這種方法能最大限度地保持樣品原來的形態,比如新冠病毒。固定+溶劑置換+超臨界乾燥已經成了現在生物電鏡制樣的規範流程。
正如不同膚質膚色的人化妝策略不一樣,對於這兩種不同的電鏡,後續病毒樣品的處理有著各異的思路。
撲粉
化妝時,想讓皮膚顯白要撲粉,這樣才能讓皮膚反射更多的光子,擁有一副光彩照人的模樣。不僅人愛美,病毒拍電鏡照片前也得“撲粉”。
掃描電鏡依靠二次電子和背散射電子,想看到清晰明亮的圖像,就得讓電子被樣品“彈回去”。
想讓二次電子多,樣品就得有足夠數量的核外電子,不然電子束流打進樣品,樣品自身電子也沒法獲得能量躍出表面。
想讓背散射電子多,樣品原子核就得大,如果原子核小,樣品中過於空曠,電子束很容易穿透樣品。
另外,如果樣品不導電,比如病毒類生物製劑,電子槍打過來的電子就會在樣品表面積累電荷,這些電荷會影響後續電子束流的運動,最終讓圖像失真。
所以,需要在生物樣品上蓋一層導電的材料,最好還是惰性強的重金屬元素。
重金屬元素核外電子多,原子核大,能產生更多的二次電子和背散射電子,有利於獲得更好的圖像。現在實驗室裡一般會採用鍍金和鍍碳的手法。
對於掃描電鏡,完成鍍膜後的病毒樣品就完成所有化妝的步驟,終於可以曝光了。
不過對於透射電鏡,鍍膜這種行為就是負擔。
透射電鏡利用的是“穿透”樣品的電子,透射電子越多,信號越強,越有利於成像。
如果鍍膜,電子都給散射沒了,透不過去。類似上課得化淡妝,參加大型活動化得濃,針對透射電鏡,病毒也另一套化妝方案。
樹脂包埋
既然要電子能透過去,就不能讓樣品太厚。所以最關鍵的一點就是讓樣品變薄。
切片方式
透射電鏡的樣品一般需要100nm以下,大約500片這樣的樣品疊起來才有一根頭髮絲的直徑大小。做過菜的都知道,給肉塊切片它們老是亂動,很容易切歪,沿著頭髮絲直徑切不太像人能幹的活。
另外,脫了水的樣品就像一塊中空結構的薯片,很脆弱,在強大的電子束流下,這麼薄的樣品很容易被打到變形(事實上,經常出現做透射電鏡表徵把樣品打出個洞的情形)。
為了解決這兩個問題,科學家們想到先用樹脂把病毒樣品包封起來,就像拿熱的豬皮凍(液體)滲入薯片後,再冷卻到室溫,豬皮凍會變成固體,相當於給薯片一個結構的支撐。
右上角是大塊的樹脂
類似地,液態樹脂是一些聚合物單體,屬於小分子,很容易滲入病毒和周圍組織。浸泡一段時間後,加熱將樹脂單體交聯成大分子聚合物,之後用特殊的切片方式就能把樣品切到100nm以下。
三角形的那個就是刀片
給病毒塗口紅
生活經驗告訴我們(作者剛查的),化妝的最後一步是塗口紅。我猜測主要目的是增強對比度
類似地,想讓病毒被看得更清晰,可以把病毒染得更黑。考慮到透射電鏡圖片下的黑主要是因為電子透不過去,所以可以選用重金屬元素和病毒結合。
實驗室中常用醋酸鈾和檸檬酸鉛,這兩種化學物質可以和病毒樣品中的蛋白、磷脂以及核酸反應並結合,電子束打過來的時候病毒就變得更“黑”,能有效幫助觀察。這種方法叫做正染色技術。
如果不染色,更不清楚,甚至難以分辨右圖的輪廓,這張圖也有可能是操作有問題的負染
除了有正染,也有負染。負染不需要前述的固定和樹脂包埋等步驟,只需要提取病毒然後染色,再幹燥樣品製片就行。對於病毒樣品,負染技術使用得更頻繁,這麼一看,病毒似乎不怎麼需要化妝,天生麗質。
有意思的是,一開始幾張公佈出來的新型冠狀病毒透射電鏡照片似乎用的是正染(比如上圖),不過也有可能是負染,因為上圖同時具有正染(病毒黑,背景白)和負染(病毒周圍黑,病毒白)的特點。可能是急著出圖,妝化急了。
當然,最近公佈的新冠病毒負染照片看起來就專業多了。
負染環境黑
請留步
需要說明一點,在固定脫水那一步,病毒已經“死亡”,如果我們想動態地看病毒如何入侵正常細胞,還是需要光學顯微鏡。
但是,上期說普通光學顯微鏡分辨率達不到 ,下篇文章專門介紹幾種超分辨率顯微技術,2014年諾貝爾化學獎給的就是幾位這個領域的祖師爺,感興趣的朋友可以點個關注。
STORM技術拍攝到的細胞裡的actin,邊界是細胞膜