實驗室基礎:甘油凍存菌、引物、質粒的保存

隨著科研的深入、課題的進展,我們會從商家購買質粒菌種訂購引物,我們自己也會構建許許多多的克隆載體。幾乎實驗室所有人都會產生很多凍存菌、引物及質粒。那麼如何保存以及管理這麼多的實驗產物呢?

實驗室基礎:甘油凍存菌、引物、質粒的保存

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很多人一定見過上面的白色凍存盒,對於條件好點的實驗室其使用的凍存盒可能更高檔。一般凍存盒都是9*9格的,可以先對盒子進行編號,1,2,3...等,再對每個盒子內部每小格進行編號,如A1,A2,B1...等。這個任何一個盒子的任意一格都有了唯一的編號對應,如3C8,指的是第三號盒子的C8格。

建立好編號之後,再在標準的Excel表格中,建立起位置和凍存物的對應關係。還應記錄下凍存菌/引物/質粒的信息(如名稱,序號,狀態,凍存時間等)。填寫好相關信息後,再將凍存菌/引物/質粒放於凍存盒的預定位置,保存到合適溫度的冰箱或液氮罐中。這樣大家就可以有條不紊的管理自己的“小金庫”了,下面我們針對不同類型的凍存物,具體看看其保存方法。

簡介

按照菌種類型(如DH5α或者表達菌)的不同,分盒保存。凍存盒中的凍存管,可按凍存時間排列。凍存菌保存在-80℃冰箱或液氮罐中。

材料(MATERIALS)

50%(v/v)滅菌甘油

2 mL 無菌凍存管

1 mL已滅菌的槍頭

無菌接種環或滅菌槍頭,含有合適抗生素或無抗的LB板

實驗步驟(PROCEDURE)

>>> 甘油菌的凍存:

  1. 一般保種用的菌液要求濃一些,因此培養時間可以比平時長一些,一般過夜即可;
  2. 在無菌操作條件下,分別向已滅菌的2mL凍存管中,加入500uL菌液和500uL 50%甘油溶液,輕輕混勻,務必充分混勻;
  3. 甘油凍存菌可以直接保存在-80℃中,有時為了減少菌體因冰晶形成而死亡,也會使用液氮速凍之後在放到-80℃冰箱保存。該凍存菌可在此條件下保存數年之久。隨後的凍存和融化操作將會減少保存年限。

(注意:與菌液接觸的物品,如槍頭、凍存管、50%甘油溶液均需要處於無菌狀態,並保證操作在無菌條件下進行。)

>>> 甘油菌的復甦:

  1. 從甘油凍存菌中復甦細菌,在無菌條件下,打開蓋子,使用無菌接種環或滅菌槍頭從凍存管中刮取適量凍存菌,劃線接種到LB板(含有合適抗生素或無抗)上。操作應適當快一些,以減少凍存管內的融化。
  2. 在合適的溫度條件下,將劃線接種的LB板進行過夜培養。過夜培養後,挑取單個克隆進行後續操作。
  3. (注意:所有東西準備完全後,再去-80℃冰箱取出保種菌,劃線動作要快,時間拖得太長會融化凍存菌,而這導致保種菌死亡。)

參考鏈接:http://www.addgene.org/recipient-instructions/create-glycerol-stock/

簡介

按照用途,引物分為PCR引物,測序引物。而按照存在狀態,引物則分為乾粉/薄膜狀態、100 uM稀釋狀態、10 uM稀釋狀態(10 uM為PCR的通常使用濃度)等三種狀態。

材料(MATERIALS)

1.5 mL EP管

無菌蒸餾水

實驗步驟(PROCEDURE)

引物一般有兩管(均為乾粉狀態),其中一管可直接保存,而另外一管可稀釋其中引物的濃度至10uM(使用濃度)。兩管放置可在同一個凍存盒中的相鄰位置,按引物序號排列。

PCR引物則根據引物的濃度不同(一般只有100uM和10uM兩種)進行分盒保存。在每一個凍存盒中,按照引物序號依次排列。引物保存在-20℃冰箱中。

>> 引物稀釋:

先將裝有引物的EP管進行離心,12000g 離心1 分鐘,將乾粉或薄膜狀態的引物離心至管底。然後,根據引物管上指示的體積,加入對應量的無菌蒸餾水,使用槍頭吹打混勻,即可得到濃度為100uM的引物。對其進行10倍稀釋,即可得到濃度為10uM的引物。

簡介

按照用途,質粒一般分為PCR模板型質粒(用於擴增目的基因片段)和蛋白表達型質粒(用於表達目的蛋白)。可按照用途的不同,分盒保存。經常使用的質粒可以保存在-20℃冰箱中,長期保存建議放在-80℃冰箱。

對於新構建的質粒或者購買回來的載體,建議測序正確後再多提幾管,放在-80℃冰箱保存。

此外,還可以將質粒轉入合適的感受態菌株中,通過保存菌種的方法達到保存質粒的目的。


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