►Christian B. Anfinsen 圖源：nobelprize.org
1972年，美國科學家克里斯蒂安·B·安芬森（Christian B. Anfinsen，1916.3.26-1995.5.14）因“對核糖核酸酶的研究，特別是對其氨基酸序列與生物活性構象之間的聯繫的研究”獲得二分之一諾貝爾化學獎。美國著名的生物化學家、生物物理學家David S. Eisenberg在一篇文章裡回憶，Anfinsen開創了近代蛋白質摺疊研究的新時代的著名實驗在其之前就被耶魯大學教授Frederic Richards的學生Lisa Steiner做過了，但當時誰也沒有當回事，甚至覺得不值得發表。實際上，1959年中國科學家人工合成胰島素與Anfinsen的實驗也極為相似。為什麼這些科學家過科學聖殿之“門”而沒入呢？本文討論了其中的奧秘。
撰文 | 王志珍（中國科學院生物物理所研究員）
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最近一位美國朋友與我談起他剛在Cell上看到的一篇文章，講美國耶魯大學醫學院一個女研究生早在諾貝爾化學獎得主Christian Anfinsen之前就做過核糖核酸酶的變性和自復性，其實驗內容和結果與Anfinsen的實驗基本一樣。我聽了非常吃驚，以前從來沒有聽說過。
核糖核酸酶的變性和自復性實驗
學過生物化學的人應該對Anfinsen經典的核糖核酸酶變性和自復性實驗（圖1）都有印象。牛胰核糖核酸酶A能夠被高濃度尿素和還原劑-巰基乙醇徹底地變性。還原劑打開了核糖核酸酶分子內部4對二硫鍵的共價連接，尿素破壞了維繫蛋白質結構的疏水相互作用，從而將酶從其穩定結構變性為伸展的多肽鏈。蛋白質的結構是其活性和功能的前提，所以完全伸展的核糖核酸酶多肽鏈徹底喪失了催化活力。但是，當從反應體系中去除尿素和還原劑後，完全變性的多肽鏈會自發地重新摺疊形成天然的構象，同時恢復其催化活力。在這個復性過程中，酶分子的8個半胱氨酸殘基必須形成其天然構象中原有的4對二硫鍵。從數學概率計算，8個半胱氨酸殘基隨機配對形成4對二硫鍵的組合共有105種，形成天然構象中的4對二硫鍵形式的概率是1/105。在Anfinsen這一實驗中，多肽鏈沒有依靠任何其他輔助因素就找到了這1/105可能的天然構象，說明尿素破壞的蛋白質分子內部的弱相互作用對二硫鍵的正確形成以及天然構象的實現至關重要。正是基於這一經典實驗，Anfinsen提出了“the amino acid sequence of a polypeptide chain contains all of the information for its three dimensional structure”（多肽鏈氨基酸序列含有其三維結構的全部信息），即我們說的“一級結構決定高級結構”的著名論斷，並因此獲得1972年諾貝爾化學獎。Anfinsen的工作開創了近代蛋白質摺疊研究的新時代，這個著名實驗早已載入世界上多本經典生物化學教科書。
►圖1 Anfinsen 核糖核酸酶變性與自復性的實驗示意圖
是誰在Anfinsen之前就做過這一實驗？
這個經典實驗竟然在Anfinsen之前就有人做過了？！我立即去讀了6月28日Cell上Leading Edge Stories 欄目發表的文章“How Hard It Is Seeing What Is in Front of Your Eyes”。
作者David S. Eisenberg是美國著名的生物化學家、生物物理學家，他是加利福尼亞大學洛杉磯分校化學與生物化學系教授，霍華德休斯醫學研究所研究員，美國科學院院士和美國藝術與科學學院院士。他的研究揭示了蛋白質錯誤摺疊形成澱粉樣沉澱的結構基礎。
在這篇文章裡，Eisenberg回憶起1995年7月參加Advances in Protein Chemistry雜誌一年一度編委午餐會的情形。當時，同為編委的Anfinsen因為在兩個月前去世首次缺席。懷著對Anfinsen的思念和對他的實驗的興趣，作者問起鄰座的Frederic Richards，當Anfinsen在做核糖核酸酶的變性和自復性實驗時他在思考些什麼。Frederic Richards是耶魯大學分子生物物理與生物化學系教授、創繫系主任，也是美國科學院院士和美國藝術與科學學院院士，他標誌性的工作是1967年測定了核糖核酸酶的晶體結構，這是美國第一個、全世界第三個解析的蛋白質晶體結構。Richards的回答把作者嚇了一大跳，“當時我沒有什麼太多的想法，因為我的學生在更早的時候就做過一模一樣的實驗”，但是這個工作“沒有發表，我們當時認為並不值得發表”。
午餐會一週後，Eisenberg收到了Richards的來信，重申了他的學生Lisa Steiner在Anfinsen第一篇論文發表之前就完成了核糖核酸酶A的變性復性實驗，只是寫好的畢業論文到1959年才最後提交。信中附上了Lisa Steiner畢業論文中記錄關鍵數據的幾頁和他們的結論：“Air oxidation of fully or partially inactivated protein resulted, in some cases, in the recovery of up to 40% of the enzyme activity which had been lost as a result of reduction.”（“還原引起部分或完全失活的蛋白質通過空氣氧化有時可恢復高達40%的酶活力。”）
幾年後Eisenberg與已經是美國麻省理工學院生物系免疫學教授的Lisa Steiner相識，聊起了她那篇畢業論文。原來早在1956年夏天，Lisa就開始在Richards的指導下開展了核糖核酸酶A的變性復性課題的研究工作。作者問起Lisa看到Anfinsen文章時的感受，她說，“我很高興他們發現了和我一樣的結果”。當被問到她怎麼看待Anfinsen因為新的發現（她甚至先於Anfinsen就看到了類似的實驗現象啊！）而獲得無數的榮譽和獎勵時，Lisa沒有表現出絲毫的自怨和苦澀，“事情就應該是這樣的。Anfinsen理解了這個發現背後的意義，而我們沒有”。雖然與蛋白質摺疊的重要發現失之交臂，但這並沒有影響Lisa後來的職業生涯，她成為了美國麻省理工學院生物系歷史上聘任的首位女性教授。
Richards在給Eisenberg信中最後寫道，“It’s an amusing example of how hard it can be to see what is in front your eyes!（這是個有趣的例子，看見就在你眼前的東西多麼不容易！）”
而Eisenberg陷入了深深的疑問，怎麼可能這樣？
Richards是一位思維清晰的、善於表達、那麼具有創造力和科學進取心的科學家，他為什麼沒能發表那些結果呢？其實不僅僅是Richards沒有意識到這是一項諾獎級別的發現，當時耶魯生物物理與生物化學系的系主任Joseph Fruton，也是當時數本最權威的生化教科書的主要作者，在評閱Steiner畢業論文時也只是修改了thioglycolic acid的拼寫。
胰島素人工合成中蘊含的蛋白質摺疊問題
差不多同一時間，一個類似的研究工作在地球另一端的中國進行。人工全合成具有全部生物活性的牛胰島素一直是中國引以自豪的代表性成果。1958年，在大躍進的高潮中，中國最優秀的生物化學家和有機化學家們確定了向國慶10週年的獻禮項目“合成一個蛋白質——胰島素”。當時國際上已經有了合成不同長度肽段的經驗，但還沒有合成蛋白質的先例，特別是由2條肽鏈組成、並含有多對二硫鍵的蛋白質的先例。經過討論最後選定了在當時的知識和技術條件下唯一可行的方案，即先分別合成A鏈和B鏈，再把2條鏈重組成胰島素分子。
這個方案的關鍵是A、B 鏈能否重組成有活性的胰島素分子。35歲的鄒承魯帶著幾位大學畢業不久的年輕同事承擔了胰島素拆合的工作，就是把天然胰島素拆成A和B鏈，研究能否把分開的A和B鏈重組成天然胰島素。這實際上是一個極其複雜的事情（圖2）。
►圖2胰島素A鏈和B鏈拆合實驗示意圖
（僅列出一條A鏈和一條B鏈可能的15種氧化重組模式）
A鏈有4個半胱氨酸殘基，B鏈有2個半胱氨酸殘基，理論上這些半胱氨酸殘基在溶液中可以自由地、隨機地氧化而生成二硫鍵。假定溶液中僅有一條A鏈和一條B鏈，可能的氧化重組模式就有15種，其中僅一種為天然分子的配對方式，也就是說生成天然胰島素的概率為6.7%。隨著溶液中A鏈和B鏈數目的加大，A鏈與A鏈之間，B鏈與B鏈之間，A鏈與B鏈之間，可能的連接方式的數目將呈現指數級的增長。所以二硫鍵可能的連接方式有無窮多種，在理論上從溶液中分離的A鏈和B鏈是無法重組得到天然胰島素的！
但是鄒承魯團隊居然在1959年就把重組胰島素的活力恢復到了10％！生化所曾向科學院黨組申請儘快發表重合成的成果，但由於當時德國Zahn和美國Katsoyannis的兩個研究小組也在進行胰島素合成的研究，基於對競爭對手的防範，中國的這個結果是必須保密的，黨組沒有同意生化所的要求。
一直到1960年，Dixon和Wardlaw在Nature上報道了還原的胰島素A鏈和B鏈共同氧化得到1-2%的胰島素活力恢復之後，他們才於1961年10月在《中國科學》復刊後的第一期上發表了活力恢復達到10%的結果。以後他們又不斷改善重組條件，使活力恢復達到以B鏈計算的30%。1966年4月，“文革”前夕，王應睞、鄒承魯應邀參加在華沙舉行的第三屆歐洲生化學會大會，鄒承魯縮短了自己的報告時間，讓給胰島素合成的主要參與者龔嶽亭（儘管會前提交了胰島素合成的論文，但龔並沒有被邀請做報告）報告胰島素合成的工作。這引起了因胰島素蛋白測序獲得諾貝爾化學獎的Frederick Sanger的極大興趣和高度讚譽。他說這是一項重大的工作，也釋放了他思想上的負擔，因為曾有人報道與他測定的牛胰島素序列的差異，所以中國人的工作是他測定的牛胰島素序列的有力證據。
鄒承魯團隊成功完成了胰島素A、B鏈拆合的先導性工作，解決了合成的路線問題，而且保證了化學合成的A鏈和B鏈以高產率重組成活性胰島素分子。其實胰島素A和B鏈重組的實驗與Anfinsen的實驗非常相似，後者是將變性的、4個二硫鍵全部還原的核糖核酸酶肽鏈重新氧化摺疊恢復活力。核糖核酸酶只有一條肽鏈，其4個二硫鍵的所有組合方式亦僅有105種可能性；而胰島素則是由2條肽鏈組成，2條肽鏈可能以不同的比例與方式組合，其6個巰基所有的可能組合方式則是無窮多。與單肽鏈的核糖核酸酶相比，胰島素的復性問題要複雜得多。中國小組所得到的10％的活力恢復結果，在本質上遠遠超過二硫鍵隨機配對的幾率。這使他們當時就得出了“在所有可能的重氧化產物中，胰島素結構還是一種比較穩定的結構，甚至在各種AB異構物之中，還是最穩定的結構之一”的重要結論。
不幸的是，由於此工作的任務導向性加上“文革”的種種干擾，胰島素人工合成工作中初放的蛋白質摺疊問題的碩大蓓蕾卻沒有及時綻放。直到70年代末改革開放後，探討胰島素拆合成功的基礎研究才在北京的中科院生物物理研究所揚帆啟航，開展了“胰島素A、B鏈相互作用的研究”，進一步總結出胰島素分子摺疊的觀點，發表在Trends Biol. Sci上：“胰島素A、B鏈本身已經具有一定的結構，含有形成天然胰島素正確結構的全部信息，能在溶液中相互識別和相互作用從而導致三個二硫鍵（二個鏈間二硫鍵和一個鏈內二硫鍵）正確配對，形成結構最穩定的天然胰島素分子”，闡明從人工化學合成的胰島素A鏈和B鏈生成天然胰島素分子的蛋白質摺疊規律，揭示了人工合成胰島素中A、B鏈重組成功的理論基礎。
不畏浮雲遮望眼，只緣身在最高層
回到前面Eisenberg的問題，為什麼Frederic Richards這樣的頂尖科學家沒能發表他與Anfinsen類似的工作？蛋白質科學研究的先驅John T Edsall給出了他的答案，解釋了為什麼聰明的科學家也可能看不見他眼前的東西。Edsall是哈佛大學醫學院、生物系教授，美國科學院院士，美國藝術與科學學院院士，也是Anfinsen、Eisenberg和Richards共同的導師，最早提出疏水相互作用在穩定蛋白質結構中的作用。
Lisa在耶魯的那個時期（1956-1959），最火熱的科學問題是生物遺傳信息如何從基因傳遞到蛋白質。1955年發現了核糖體，1956年發現了tRNA，1958年Crick提出了他的中心法則，1961年解析了遺傳密碼。當Anfinsen開始他的蛋白質摺疊的工作時，生物合成和遺傳密碼已積累了大量新的發現。顯然，合成完成的多肽鏈帶著由遺傳密碼指定的序列，像一條彎彎扭扭的鏈條從核糖體釋放出來，也就是一個變性的蛋白質，它必須找到一條途徑，在分子伴侶的幫助下或靠它自己，達到其特有的三維結構。自然界如何複製正確序列的問題已經基本解決了，所有這些發現必然導致對蛋白質摺疊問題的格外關注。所以能提出“DNA的一維信息如何決定蛋白質的三維結構”這個問題的科學發展背景只能是1960年代早期而不能是1950年代的中期。解決這個問題需要一種新的思維。Anfinsen經過一系列研究工作逐漸發展的新理論“熱力學假說（Thermodynamic hypothesis）”就在這一時間應運而生。就如Anfinsen在他的諾貝爾獎獲獎演說中描述的那樣：“一個天然蛋白在其生理環境中……的三維結構是整個系統的Gibbs自由能最低的結構；也就是說，蛋白質在特定環境下的天然構象是由組成它的所有原子相互作用的總和決定的，換言之是由其氨基酸序列決定的。”
設想這樣的場景：Lisa Steiner在她剛走上科研道路之時就看到了一扇門，但是由於當時科學的發展還不足以讓她，還有她的導師和系主任，意識到這是一扇特別重要的門，到了它的面前，卻又自己離開了；鄒承魯等人在用他們選定的策略執行一個特定任務的路程中必然會看到這扇門，他們也到過它的面前，感覺到它的神秘性，但由於任務的催促和種種其他原因也被帶離了，沒有去敲開這扇門。而恰恰是在科學發展到遺傳信息傳遞的分子生物學中心法則基本成形的背景下，Anfinsen對科學問題的自由探索導致他有目標地尋找一座藏著“DNA的一維信息如何決定蛋白質的三維結構”秘密的聖殿，這時他對這扇聖殿的“門”會特別敏感，創造性地運用 “熱力學假說”，一旦確定了聖殿的大門，就竭盡全力打開它，繼續尋找藏寶的殿堂，直至找到聖寶。
是啊，科學發現往往不會是所見即所得。我們科學家需要聚精會神的心態和一雙明亮的眼睛去仔細觀察實驗結果，但更重要的是能夠進一步洞察發現的現象後面的實質性的規律，也就是科學問題的本質。我們每一個人不是總可以做到的。所以Fred Richards說要看見就在你眼前的東西是多麼難啊。
後 記
寫此文讓我又回憶起我1995年在德國做訪問研究時的一件事。在Gottingen很容易在圖書館及時看到剛剛出版的雜誌。我就是在本文所述的Advances in Protein Chemistry這本蛋白質研究的權威性綜述叢書的第47捲上，讀到了J. T. Edsall教授的文章“Hsien Wu and the First Theory of Protein Denaturation （1931）”【“吳憲與第一個蛋白質變性理論（1931）”】，它對吳憲教授的學術成就給予了極高的評價。該刊還同時重新全文刊登了吳憲教授1931年用英文發表在《中國生理學雜誌》（Chin. J. Physiol. 5:321-344）的關於蛋白質變性的論文：“Study on Denaturation of Proteins. XIII．A Theory of Denaturation.”（蛋白質變性研究XIII.變性的理論），也就是說把一篇1931年在中國雜誌上發表的論文在六十四年後再次全文刊登在國際一流的叢書上，不能不說是一件罕見的科學奇事。Edsall的這篇文章確認第一個蛋白質變性理論是1931年由中國科學家吳憲首先提出的。
時光再回到1995年的波士頓，Advances in Protein Chemistry的編委午餐會正好遇上少有的又悶又熱、難於呼吸的天氣，Edsall教授 92歲，卻乘地鐵去參加這個重要會議，會後被Eisenberg說服打車回家。90多歲還是要相信自己，要有勇氣去做力所能及的事情。
感謝中國科學院生物物理所王曦副研究員對此文的完成提供的建議和幫助。
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