在液相色譜中，給你一個樣品，如何來選擇流動相將樣品分開？在什麼情況下使用緩衝溶液？緩衝溶液的選擇有什麼技術要求？
什麼時候需要緩衝溶液？
在反相色譜分析中，流動相的pH值一般在2-7之間，當分析物在反相條件下可離解，或樣品的pH值在2－7之外時，就需要緩衝液，在反相條件下可離解的化合物一般有氨基和羧基，他們的pKa在1－11之間，選擇正確的緩衝液pH值可保證可離解的官能團處於一種形式，離子形式或中性化合物的形式；如果樣品的pH值對柱子有傷害，則緩衝溶液可使其變溫和或減小其危害，常規硅膠基質色譜柱的pH耐受範圍2-8。
如何選擇緩衝液pH值
在選擇緩衝液pH值之前，應先了解被分析物的pKa，高於或低於pKa兩個單位的值，有助於獲得良好的峰形，溶液PH值高於或低於兩個pKa兩個單位，化合物99％以一種形式存在。一種形式存在的化合物才能獲得好的尖銳的峰。
先了解幾個概念
緩衝溶液：能抵抗外來少量強酸、強鹼或稍加稀釋，而能保持其pH基本不變的溶液，稱為緩衝溶液（buffer solution）。
緩衝溶液對強酸、強鹼或稀釋的抵抗作用稱為緩衝作用（buffer action）
緩衝容量(b)：使單位體積緩衝溶液的pH改變1個單位時,所需加入的強酸、強鹼的物質的量。是衡量緩衝溶液緩衝能力大小的尺度。單位：mol/L·pH或mmol/L·pH
pH：氫離子濃度指數（hydrogen ion concentration）是指溶液中氫離子的總數和總物質的量的比。
pKa：
緩衝溶液組成
普通緩衝溶液：由共軛酸鹼對組成，用於控制溶液酸鹼度。
標準緩衝溶液—它是由規定濃度的某些逐級離解常數相差較小的單一兩性物質或不同型體的兩性物質所組成。校正pH計用的標準緩衝溶液，如酒石酸氫鉀、鄰苯二甲酸氫鉀、硼砂的溶液也具有緩衝作用。
瞭解完基本概念之後，再來看一下今天的正題如何確定適當的pH適用範圍：
本思路僅適用於反向色譜法分析離子化合物方法開發中流動相pH的確定。
一.考察離子化合物的pKa值
在反相色譜分析中通常不要求化合物精確的pKa值，我們可以通過查閱文獻或者根據化合物的結構按照下圖中列出的主要酸鹼官能團在水溶液的pKa值進行推測。
注意：按照上表中官能團進行估算時分子中相鄰基團的不同會導致pKa出現1-2個單位的差異。對於酸性化合物，當含有吸電子基團時會導致酸性增強，pKa值相應降低；對於鹼性化合物，當含有吸電子基團時會導致鹼性降低，pKa值相應降低。
二.根據化合物pKa值推測流動相相應使用的pH
先看下流動相pH對酸鹼化合物的影響：
1.流動相pH對不同pKa化合物的保留時間的影響
根據這幅圖，我們可以看出，當流動相的pH約等於化合物的pKa時，可以最大限度的調整化合物的保留時間。此時改變0.1個單位的pH可以使得保留因子k變化10%，可引起分離度±2.5個單位的變動。但此時需要進行精確控制流動相的pH，這要求把流動相pH控制在0.02個單位以內，在實驗室很難控制，重現性較差，成為分析的瓶頸。
但我們實驗時可以將pH範圍放寬，只要將流動相pH控制在化合物pKa值±1.5個單位的範圍內（上圖所示的II範圍內）就可以對化合物保留行為產生比較明顯的影響，此時進行分離選擇性較好。同時為了更好地控制保留行為的重現性，需要控制緩衝液的pH在±0.1個單位以內(當流動相pH控制範圍較窄時建議使用緩衝鹽的質量進行控制，比pH計進行控制效果更優)。
通過以上三點分析我們可以得出，待分析化合物的pKa與確定流動相的pH有很大的關係。主要依據化合物出峰時間、化合物的峰型及所需要分離目標的化合物綜合考慮來確定流動相的pH。
可能有的同事會發現第二點和第三點是有些矛盾的，這時候就需要對自己的實驗進行初步的探索，看看是否pH值會對化合物的峰型產生影響（有的專家認為該觀點缺乏理論和實踐的支持）或者是否需要準確調節pH在化合物pKa±1.5範圍內進行提高選擇性。
筆者在做實驗時發現有的物質會因稀釋液pH使用不當產生峰分叉的現象，調節稀釋液的pH即可解決峰的分叉；有時流動相pH在化合物的pKa±2的範圍內時離子化合物並沒有出現峰分叉、峰型不好現象。
三.根據流動相pH值測定所需要的緩衝鹽
1.緩衝液選擇主要依據：
（1）緩衝溶液的pKa和緩衝容量
（2）溶解度
（3）紫外吸收
2.對以上三點進行說明
(1)一般緩衝溶液的pKa值與流動相的pH相等時緩衝能力最大，pKa與流動相的pH相差越大，緩衝液的緩衝能力越差。一般要求流動相的pH與緩衝液的pKa值不能超過±1.0個單位，當緩衝溶液濃度較高時可以放寬範圍到1.5個單位。常用的緩衝液的緩衝範圍見下圖：
緩衝溶液的濃度一般在5-50mmol，因過低導致緩衝能力不足（可通過調整進樣體積查看化合物峰型的變化，如果出現拖尾或者前沿現象，說明緩衝溶液的能力不足）；緩衝液濃度過大會導致與有機相混溶時鹽的析出，對儀器、色譜柱都會產生損傷，而且使得基線不好。一般初始摸索方法時推薦使用25mmol。
（2）根據緩衝液溶解度：在酸性緩衝溶液中，如磷酸鹽，緩衝液溶解度順序：鈉鹽＜鉀鹽＜銨鹽；有研究發現，當pH=7時10mmol的磷酸鉀在85%甲醇或者75%乙腈中可以溶解，在pH=3時，在85%甲醇或者85%乙腈中可以完全溶解（此測試通過使用容器將不同比例的混合溶劑進行混合，觀察大約30min，是否有沉澱產生，否則就要降低緩衝液的濃度或者有機相的含量，在梯度洗脫時尤為注意）。
（3）根據化合物的吸收波長：在pH≤3.5，6.0≤pH≤8.5或者pH≥11.0磷酸鹽緩衝液是不錯的選擇。而甲酸鹽和乙酸鹽緩衝液的範圍是2.5～6.0，適用於210納米或者更高吸收的檢測波長。
3. 緩衝鹽的作用：
緩衝鹽的種類或者濃度對選擇性的改變會很小，只是起到緩衝作用，提高化合物的保留時間的穩定性。
高效液相色譜法中選擇緩衝鹽的注意事項
在高效液相色譜法中，分離酸或鹼緩衝溶液對維持流動相恆定pH和提高保留時間的重現性都非常重要。
怎麼選擇緩衝液：
Pka和緩衝容量
溶解度
紫外吸光度（使用UV檢測器）
揮發性（MS蒸發光散射檢測器）
離子對性質
穩定性和儀器的兼容性
根據以上的理論，流動相緩衝容量取決於緩衝鹽的pka，緩衝鹽濃度，流動相pH。
當緩衝液中溶質的的兩種形態（HA和 A-）濃度相等時，即緩衝鹽的pka與流動相pH相等時，緩衝能力最大。當流動相的pH與緩衝鹽的pka相差越大，緩衝鹽的緩衝容量就越小。因此緩衝的pka與流動相的pH相差不能超過±1.0個單位。
流動相的緩衝容量一般與緩衝液濃度成正比關係，通常濃度範圍為5~25mmol/l。
樣品溶解在流動相中可以避免在反相色譜過程中發生緩衝能力的問題，尤其是流動相緩衝液濃度較低或注入樣品量較大的時候尤為重要。
當緩衝容量偏低時，可以從以下方面調節緩衝容量：
1、減少緩衝液pKa與流動相pH之間的差異（可調節pH或更換緩衝液）
2、礦大流動相pH和溶質pKa之間的差異（當差異足夠大時，溶質倍完全離子化或者保持非離子化形式此時緩衝液顯的不重要了）
3、增加緩衝液濃度
4、減少樣品進樣體積
5、調節樣品的pH與流動相的一致。
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