Elon Musk說“It is amazingly hard to find a simple solution. A complicated one is relatively easy”，可見尋找複雜問題的簡易解答並不容易。今天為大家分享一個來自北京大學呂華研究員課題組的最新進展，為實現聚二硫化物在蛋白質表面的原位生長提供了一個極簡的解決方案(Cryopolymerization of 1,2-Dithiolanes for the Facile and Reversible Grafting-from Synthesis of Protein−Polydisulfide Conjugates)。作者通過冷凍提高了聚合反應平衡常數，利用冰晶生長過程中的溶質排出效應提高反應底物局部濃度，成功地以Grafting-from（GF）的方式可控制備了可無痕釋放的蛋白質-聚二硫化物偶聯物。製備蛋白質-高分子偶聯物（PPCs）的方法主要有兩種：一種是將預先合成的高分子與目標蛋白質（POI）進行偶聯（GT），另一種是從POI原位聚合得到（GF）。其中GF的純化步驟和合成路線更為簡便，效率更高，是較為理想的一種合成方式。但目前可用於GF的聚合方法仍非常有限，主要包括可控自由基聚合如ATRP和RAFT。這些方法通常需要以化學或者基因工程手段在蛋白上引入合適的引發基團，且只能在蛋白上生長不可降解的高分子。因此亟需開發一種能夠從天然蛋白質原位接枝可降解聚合物的簡單有效方法。
聚二硫化物是一類以動態二硫鍵為主鏈的聚合物，日內瓦大學Matile等人證明其是一類優異的胞內遞送材料。新加坡國立大學Yao課題組以GT的方式實現了蛋白質與聚二硫化物的偶聯，並用其高效地將蛋白質遞送至細胞質。蛋白質半胱氨酸側鏈的活性巰基常被選作小分子的修飾位點，理論上亦能用於引發環狀單體如1,2-二硫戊環的開環聚合，以GF的方法構築蛋白質-聚二硫化物（protein-PDS）偶聯物，然而該構想一直未能實現。基於小分子巰基引發劑的實驗表明該類單體如硫辛酸（M1）在水相及室溫下的平衡單體濃度高達262 mM，然而若以插入了活性半胱氨酸的綠色熒光蛋白（Tev-Cys-EGFP）為引發劑，即使在300 mM單體溶液中都無法引發聚合；如此高的單體濃度也常常引發副反應導致蛋白質沉澱或失活，生物兼容性差。
圖1 A) 蛋白質引發的1,2-二硫戊烷的冷凍聚合反應示意圖; B) 25和-10 ℃下，TEV-Cys-EGFP和M1的反應混合物的熒光顯微鏡照片。
為了實現蛋白原位引發聚合，作者選擇了降低溫度這一反直覺的策略，以較高的引發效率得到了聚合產物。該策略通過以下兩點因素推動了反應平衡向聚合進行：1. 削弱因熵減而帶來的熱力學不利因素，從而提高聚合的平衡常數；2. 在冷凍系統中溶質被冰晶排出導致底物局部濃度升高（如圖1）。通過對反應溫度、時間、濃度和pH的篩選，作者發現該聚合反應在優化的條件下反應速度快（2h完成）、符合活性聚合的特徵、引發效率高、分子量可控、分散度窄且具有較好的蛋白與單體的普適性和特異性（如圖2）。
圖2蛋白質介導的1,2-二硫化物冷凍聚合具有活性半胱氨酸依賴性
接下來，作者展示了所製備的蛋白質-聚二硫化物偶聯物的一系列有趣的特性，包括：還原條件下如GSH或DTT即可快速且“無痕”釋放蛋白質，酶活實驗驗證了所釋放蛋白質的功能不受顯著影響。這種胞內釋放能力結合聚二硫化物優異的細胞膜穿透能力，此類偶聯物在蛋白質藥物遞送方面擁有的巨大潛力，作者隨後通過兩種模型蛋白GFP和DHFR的掃描熒光共聚焦實驗對此進行了初步驗證。
總結而言，該文開發了一種簡單通用的蛋白質原位引發開環聚合反應方法，實現了較高的聚合可控度與位點選擇性，並可以無痕的方式釋放功能蛋白，具有廣泛的化學、生物與醫學應用前景。北京大學化學與分子工程學院博士研究生鹿建華為論文第一作者，呂華研究員為通訊作者；此工作獲得了國家重點研發計劃合成生物學專項（2019YFA0904203）、國家自然科學優秀青年基金（21722401）、及博士後創新人才支持計劃（BX20190004）資助。冷凍顯微鏡實驗獲得了中科院化學所王健君研究員及
金晟琳博士的大力協助。https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.9b12937
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