在全球前10萬科學家排名的排名中，朱健康位列中國第二，在中國的生命科學領域排名第一；有趣的是，朱健康更是長期出現在全球高引用學者的名單中。在2019 年，朱健康團隊（通訊作者）發表了20篇高水平研究成果（截至2019年11月26日），在基因編輯，表觀遺傳及生物脅迫等領域取得重大突破，由於篇幅有限，iNature盤點其中的17篇文章：

【1】2019年9月27日，國際頂級綜合類期刊National Science Review（IF:13.22）在線發表了由中科院分子植物科學卓越創新中心上海植物逆境生物學研究中心朱健康研究組完成的題為“Disruption of MIR396eand MIR396f improves rice yield undernitrogen-deficient conditions”的研究論文。該成果研究了關於植物中microRNA途徑調控氮肥高效利用的最新研究進展。該研究找到了一條在高產作物品種中提高氮肥利用的有效方法，為保證作物產量、降低生產成本投入、減少環境生態影響的可持續發展農業帶來了新思路；

【2】2019年9月25日，Plant Biotechnology Journal雜誌在線發表了來自中科院上海植物逆境中心Daisuke Miki組和朱健康課題組合作題為“Gene targeting in Arabidopsis via an all-in-one strategy that uses a translational enhancer to aid Cas9 expression”的研究論文。該研究報道了在原來的方法進行改良，實現了一步到位（all-in-one）的基因打靶方法；

【3】2019年7月24日，Plant Biotechnology Journal 在線發表了朱健康院士聯合浙江農林大學和南昌大學的研究論文“Mutations in MIR396e and MIR396f increase grain size and modulate shoot architecture in rice

【4】2019年7月30日，中國科學院上海植物逆境生物學研究中心朱健康研究組在PNAS在線發表了題為"Histone Acetylation Recruits the SWR1 Complex to Regulate Active DNA Demethylation in Arabidopsis"的研究論文,該研究發現了植物主動DNA去甲基化的完整調控途徑，詳細闡述了植物主動DNA去甲基化的最新機制。該研究還揭示了擬南芥SWR1複合體通過識別常染色(組蛋白乙酰化)和異染色(DNA甲基化)標記物而被招募到染色質上的靶向機制；

【5】2019年7月5日，《Nature Plants》在線發表了美國華盛頓大學、日本名古屋大學和中科院上海植物脅迫生物學中心朱健康教授團隊合作研究的題為“Bipartite anchoring of SCREAM enforces stomatal initiation by coupling MAP kinases to SPEECHLESS”的論文。該研究利用氣孔發育這一系統，用來探究外部信號是如何被傳遞並轉化為細胞內部響應的過程，該研究結果解析了在氣孔細胞形成過程中直接將外部信號與轉錄重編程聯繫起來的機制，並闡述了植物MAPKs所採用的一種獨特的底物結合模式；

【6】2019年7月5日，

【7】Plant Biotechnology Journal 在線發表了中國科學院上海植物逆境生物學研究中心朱健康院士團隊題為“Simplified adenine base editors improve adenine base editing efficiency in rice”的研究論文，該研究發現利用用於大腸桿菌的ABE結構（ecTadA*7.10-nSpCas9 (D10A)）能顯著提高腺嘌呤鹼基編輯器在水稻中的編輯效率；

【8】2019年5月7號，朱健康研究團隊等人在PNAS上在線發表了題為Peroxisomal β-oxidation regulates histone acetylation and DNA methylation in Arabidopsis的研究論文。該研究發現過氧化物酶體中β-氧化的缺陷影響核中的組蛋白乙酰化和DNA甲基化。該研究工作為來自過氧化物酶體的逆行信號傳導提供了證據，以調節高等真核生物中的核表觀遺傳修飾。

【9】2019年3月27日，中國科學院上海植物逆境生物學研究中心朱健康課題組在Molecular Plant 發表題為“Genome engineering in rice using Cas9 variants that recognize NG PAM sequences”的研究論文。該研究使用穩定的轉基因品系來評估xCas9和SpCas9-NG在水稻中進行基因編輯和鹼基編輯的效率，極大地擴展了基因組編輯工具的靶向範圍；

【10】2019年1月30日，中國科學院上海植物脅迫生物學研究中心和分子植物科學中心朱健康&段成國研究團隊在JIPB上發表了題為“EXPORTIN 1A prevents transgene silencing in Arabidopsis by modulatingnucleo‐cytoplasmic partitioning of HDA6”的研究論文。該論文揭示了一種新的表觀遺傳調節機制，通過調節染色質調節劑的XPO1A依賴性核-細胞質分配；

【11】2019年1月25日，Nature Communications雜誌在線發表了中國科學院上海植物逆境生物學研究中心張蘅研究組和朱健康研究組題為“The genome of broomcorn millet”的研究論文。該研究完成了糜子基因組精細圖譜，為未來該作物的分子育種和功能基因組學研究奠定了基礎；該研究還通過比較基因組和轉錄組分析揭示糜子進化歷程和其特殊的C4光合作用模型。

【12】2019年1月17日，National Science Review 雜誌發表了來自中國科學院植物逆境生物學研究中心朱健康課題組和華南農業大學劉耀光課題組合作題為“Gene Editing in Plants– Progress and Challenges ”的綜述文章。該綜述就目前植物基因組編輯工具的開發和應用的目標，及潛在關注點和未來挑戰提供了獨特的觀點;

【13】2019年1月12日，PNAS期刊在線發表了中科院上海逆境生物學中心/分子植物卓越中心/植物生理生態研究所郎曌博研究組題和朱健康研究組題為“Global increase in DNA methylation during orange fruit development and ripening”的研究論文，該研究揭示了DNA甲基化在柑橘果實成熟過程中的調控作用；

【14】國際學術期刊Journal of Integrative Plant Biology在線發表了中國科學院上海植物逆境生物學研究中心雷明光課題組和朱健康課題組合作完成的題為“A Group of SUVH Methyl-DNA Binding Proteins Regulate Expression of the DNA Demethylase ROS1 inArabidopsis ”的研究論文，該研究發現SUVHs蛋白識別並結合ROS1啟動子的甲基化MEMS序列，調控ROS1基因表達和基因組甲基化水平；

【15】2019年4月22日，New Phytologis雜誌在線發表了來自中科院上海植物逆境生物學研究中心朱健康課題組題為“Arabinose biosynthesis is critical for salt stress tolerance in Arabidopsis“的研究論文。該工作揭示了Ara代謝在鹽脅迫耐受中的重要性，並且還提供了對植物中UDP-Ara生物合成所涉及的酶的新見解。

【16】2019年4月8日，Plant Biotechnology Journal在線發表了上海植物逆境生物學研究中心朱健康實驗室題為“Optimizing Base Editors for Improved Efficiency and Expanded Editing Scope in Rice”的研究論文。該工作升級了水稻之前應用的CBE和ABE鹼基編輯器，不但大幅提高了效率，而且擴大了鹼基編輯的序列選擇範圍；

【17】2019年7月9日，朱健康團隊的趙春釗及楊榮在Frontiers in Plant Science 在線發表題為“A Role for PICKLE in the Regulation of Cold and Salt Stress Tolerance in Arabidopsis”的研究論文，該研究發現PKL對於擬南芥中的冷應激反應很重要。在低溫脅迫下，PKL基因的功能喪失突變會導致幼苗出現綠葉型，這是由於某些葉綠素代謝相關基因的轉錄水平發生了變化。冷凍處理後，pkl突變體還表現出增加的電解質洩漏。這些結果表明，PKL是植物適當的耐寒性和耐寒性所必需的。在高鹽下，PKL基因的突變還導致子葉綠化率降低和主根伸長降低。總而言之，該研究結果表明PKL調節植物對寒冷和鹽脅迫的反應。

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朱健康研究組團隊人員，從前期構建的水稻microRNA突變體庫中篩選到一個影響粒型和株型的關鍵調控因子miR396。儘管miR396前期被證明可能是調節調節水稻重要功能基因OsGRF4的一個關鍵因子，但具體miR396成員間調節作用的差異未見研究報道。根據miRBase註釋，水稻中miR396共有8個家族成員。各個成員間成熟區序列有相似性和核酸多態性。進一步分析發現，各個成員在不同組織中的積累水平有很大差異。其中miR396e和miR396f成員在植物生殖組織中積累水平最高。

該研究應用CRISPR/Cas9基因組編輯技術分析了miR396不同成員間的功能差異。發現在不同成員的基因編輯突變體中，只有miR396e/f突變體表現出明顯的發育表型。表現為穀粒長度和寬度明顯增加，穗長和穗分支數目增加。

進一步研究發現，miR396ef主要靶向下遊生長調節因子（GROWTH REGULATINGFACTORS）的三個功能基因OsGRF4，OsGRF6和OsGRF8來影響粒型和穗型的發育。其中，GRFs的互作因子GIF1/2/3也參與到此調節過程中。

前期研究發現，OsGRF4是氮素吸收、同化和轉運的重要調節基因。miR396e/f作為其上游調節因子是否存在響應。本實驗發現，mir396e/f突變體可以提高植物體的耐低氮逆境脅迫，在低氮條件下表現出高產穩產的特性。在未施用氮肥的實驗田塊中，mir396e/f突變體增產效果比常規條件下更為明顯。

該研究獲得了中科院戰略先導項目，國家自然科學基金，博士後基金等項目的資助。朱健康團隊張金山博士和周振宇為本論文第一作者，張輝博士（現為上海師範大學生命科學學院教授）和張金山博士為該論文的通訊作者

論文鏈接：

https://doi.org/10.1093/nsr/nwz142

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生物基因組的精準編輯是一項具有挑戰性的工作，主要包括基因的敲除、敲入、替換等。近年來，CRISPR/Cas9系統在多種生物中實現了高效的基因敲除編輯。它先在基因組產生位點特異性的雙鏈斷裂（DSB），這些雙鏈斷裂再依賴細胞的兩種內源機制來修復，一種是易錯易突變的非同源末端連接（NHEJ），另一種是需要同源DNA模板介導的無錯無差異的同源重組修復（HDR）。由於同源重組這種修復機制的發生概率較低，因此目前基因編輯領域比較高效的是造成基因突變的敲除編輯。此外，雙鏈斷裂可以提高植物細胞內同源重組的效率，通過DBS和供體DNA的配合可以初步可以實現靶標基因的敲除或敲入。然而，現有的一些方法依賴於靶標基因附近的抗生素或除草劑抗性基因來提高效率，因此顯著了實用性和帶來了外源基因問題。

圖1. DNA雙鏈斷裂細胞內源修復機制

朱健康課題組在2018年發表文章（見上面介紹），設計並使用由卵細胞和早期胚胎細胞特異性啟動子DD45驅動的Cas9系統，“一代轉化”野生型擬南芥，獲得在雌性配子和早期胚胎特異表達Cas9蛋白的植株，檢測並挑選出Cas9活性最高的株系作為母株。再依賴細胞內源同源重組機制，將基因特異的sgRNA元件和無需帶有篩選輔助標籤的目的序列DNA，“二代轉化”擬南芥Cas9母株，從而實現高效的片段定點插入或精準的鹼基替換，編輯效率在5.3%-9.1%之間。

圖2. 二代轉化策略和陽性苗篩選流程（ (Miki et al., 2018).

在該研究中，將Cas9蛋白、gRNA和HR供體序列一次性全部設計在同一個載體上進行一次轉化（如下圖所示）。此外，該研究還增加源於TMV的Ω翻譯增強子序列以增強Cas9蛋白的表達，和在HR供體序列兩側增加sgRNA識別位點及使用具有EC1.1啟動子的嵌合EC1.2 / DD45增強子來驅動Cas9表達。

該研究顯示，在不使用增強子等原件條件下，all-in-one的效率只有0.68%。而通過利用源於TMV的Ω翻譯增強子序列增強Cas9蛋白的表達，在DD45啟動子的驅動下，能將擬南芥中的編輯效率提高了3倍，達到2.4%。此外，研究發現，EC1.2/DD45的增強子配合EC1.1啟動Cas9蛋白的表達，在該體系中並沒有效果。另外，在HR供體序列兩側增加sgRNA識別位點，並不能增加敲入的效率，反而會降低基於DD45啟動子的效率。

因此，該研究表明通過all-in-one策略也可以獲得可遺傳的ROS1-GFP GT陽性植物，儘管其效率遠低於採用二步轉化方法。 此外，Ω翻譯增強子序列置於Cas9的上游可以增加all-in-one方法的基因靶向效率。

論文鏈接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1111/pbi.13265

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小RNA miR396是植物生長髮育的重要調控因子。水稻基因組中共存在8個miR396的編碼基因（MIR396a–MIR396h）。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，該研究首次對miR396的編碼基因家族進行了系統的基因編輯研究，發現

通過轉錄組、代謝組、植物激素分析等技術手段，該研究初步揭示了miR396調控葉長的機理：mir396ef雙突變可使嫩葉中赤黴素前體甲瓦龍酸（mevalonic acid，MVA）的含量增加，進而增加赤黴素的含量，從而促進葉片和葉鞘的伸長。

鑑於包穗現象不利於mir396ef雙突變材料產量潛力的發揮，朱健康研究團隊致力於mir396ef株型的改良，目前已成功克服了mir396ef包穗的問題，正嘗試將該研究成果應用於生產實踐。

該研究論文的通訊作者為中科院上海植物逆境中心朱健康院士和浙江農林大學柳參奎教授，浙江農林大學苗春波副教授和南昌大學王東教授為該論文並列第一作者和通訊作者，該研究得到中科院上海植物逆境中心、國家自然科學基金（31800241）和江西省自然科學基金的資助（20171ACB20001）。

原文鏈接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/pbi.13214

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1.研究背景

朱健康實驗室於2002年報道了首個生物體內的去甲基化酶ROS1(Gong et al., 2002)。研究表明ROS1不僅有糖基化酶活性，同時具有AP裂解酶活性，能將磷酸二酯骨架通過β-消除反應或連續的β，δ-消除反應斷開，將分別產生與3'-磷-α，β不飽和醛（3'-PUA）的間隙和3'-磷酸（3'-P）。隨後，該實驗室繼續鑑定AP核酸內切酶蛋白的APE1L具有3'-磷酸二酯酶活性，負責3'-PUA向3'-OH轉化的主要酶。而鋅指DNA 3'-磷酸酶（ZDP）將3'-P轉化為3'-OH（Martinez-Macias,2012；li Yan, 2015 ）。 因此，APE1L和ZDP是植物DNA去甲基化的途徑中下游兩種不同的分支。此外，2019年，北京大學錢偉強實驗室報道另外一種AP核酸內切酶APE2也在該途徑中與ZDP有部分功能冗餘起作用（Li jinchao, 2019）。最後，朱健康實驗室還鑑定了DNA LIGASE I (AtLIG1)連接酶參（li yan， 2015）與了DNA去甲基化途徑下游3'-OH和5-P的連接，最終實現將胞嘧啶替代含有甲基基團的胞嘧啶，達到去甲基化作用（見下圖）。

圖1. 通過鹼基切除修復途徑的ROS1介導的DNA去甲基化模型（Plant Cell， 2018）。

隨後的研究表明，組蛋白乙酰化酶IDM1蛋白介導了ROS1的主動去甲基化過程 (Qian et al., 2012)，但是其作用機制是未知的。隨後通過質譜等方法，鑑定得到IDM1結合蛋白IDM2,IDM3蛋白。研究表明它們與IDM1形成複合體也參與了該途徑（Qian Weiqiang, 2014）。近幾年，朱健康實驗室通過構建35S-SUC2系統，遺傳篩選了一系列參與ROS1去甲基化酶上游招募的蛋白。首先鑑定的是能結合DNA胞嘧啶甲基化的MBD7蛋白，並發現該蛋白能與IDM1蛋白複合體相互作用（Lang Zhaobo, 2015），隨後又遺傳篩選鑑定得到HDP1和HDP2蛋白能夠與MBD-IDM1複合體相互作用，共同參與IDM1蛋白招募到特定位點（Duan Chenguo, 2017）。因此，該實驗室一系列的研究表明了IDM1乙酰化酶招募到特定位點的機制，但是仍然沒有解決IDM1蛋白如何招募ROS1去甲基化酶來啟動DNA去甲基化？

(Cell Res, 2017)

該研究中，同樣是通過35S-SUC2系統篩選鑑定到ARP6和PIE1蛋白，兩個染色質重塑SWR1複合體中的組分蛋白（如下圖）。而之前研究表明SWR1複合體參與了H2A.Z的富集。因此，該研究檢測了h2a.z-2/-3 兩個突變體也同樣表現出參與DNA去甲基化途徑（如下圖）。

研究表明，H2A.Z促進了ROS1和IDM1的去甲基化功能，而在DNA去甲基化位點，H2A.Z的富集又依賴於IDM1蛋白，進一步研究發現，H2A.Z能夠與ROS1相互作用（見下圖）。因此，該研究表明依賴於IDM1複合體的H2A.Z富集後，能夠招募ROS1蛋白在特定位點起作用。然而，IDM1蛋白複合體如何介導H2A.Z的富集呢？

研究結果表明，染色質重塑SWR1複合體另外兩個含bromo結構域的蛋白NPX1和ATMBD9具有DNA去甲基化功能冗餘，同時能夠參與識別由IDM1建立的乙酰化組蛋白標記，乙酰化的組蛋白標記物將SWR1複合體招募到染色質上去沉積H2A.Z。

綜上所述，該研究表明了在特定基因組DNA區域中，由IDM1複合體開始在該位點富集乙酰化修飾，之後染色質重塑SWR1複合體中的NPX1和ATMBD9能識別該乙酰化修飾並招募該複合體，之後介導該位點的H2A.Z的富集。最後H2A.Z和ROS1直接相互作用從而招募ROS1去執行主動DNA去甲基化，以防止高甲基化和/或DNA甲基化的傳播（如下圖）。

綜上所有，朱健康實驗室從2002年發現ROS1開始，研究植物主動DNA去甲基化途徑。經過多年的努力，該實驗室初步建立了植物主動DNA去甲基化完整通路，包括上游的IDM1乙酰複合體招募ROS1蛋白途徑，及下游的ROS1切割含有甲基的胞嘧啶鹼基後的鹼基切除修復途徑等兩個過程。這些研究充分說明了植物主動DNA去甲基化通路的複雜性，也體現出DNA甲基化和去甲基化的途徑受到嚴格控制及其重要性。

該研究由上海植物逆境生物學研究中心聯合美國普渡大學、浙江大學、浙江省農科院等國內外研究單位共同完成，朱健康教授為該研究論文的通訊作者，聶文鋒博士和雷明光研究員是該文章的共同第一作者，朱健康教授和聶文鋒博士設計了該研究工作，浙江大學園藝系喻景權教授和奧地利科學院Fred Berger教授等參與了該研究工作。該工作得到了中國科學院、中國國家留學基金委員會等單位的經費資助。

原文鏈接：

https://www.pnas.org/content/early/2019/07/29/1906023116

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氣孔是植物氣體交換和蒸騰作用所必需的，在氣孔-表皮瓣膜的發育過程中，上游肽信號的表皮模式因子家族由氣孔前體分泌，並由鄰近細胞的ERECTA類受體激酶家族感知，激活下游的MAPK信號級聯反應，包括YODA (YDA) MAPKKK,兩個冗餘MAPKKs (MKK4和MKK5)和兩個冗餘MAPKs (MPK3和MPK6)，通過磷酸化作用抑制bHLH轉錄因子和SPEECHLESS (SPCH)阻止氣孔細胞的分化。SCREAM是一個基本的螺旋-環-螺旋結構(bHLH)的蛋白，可作為一個支架招募MPK3/6下調轉錄因子SPEECHLESS (SPCH)，該轉錄因子是氣孔前體細胞的兩個子細胞之一，可啟動氣孔細胞譜系的表達，該抑制作用導致SPCH積累減少，最終阻礙氣孔的分化過程。SCREAM可通過一種保守但非傳統性的雙邊motif直接結合MPK3/6，這個雙邊motif的突變體表現出相關功能喪失，磷酸化和降解，揭示了MPK3和MPK6之間的非冗餘性，並導致氣孔分化過程的紊亂。

作者通過bHLH蛋白SCRM功能獲得性突變體等研究揭示了SCRM促使MAPKs進入細胞核抑制SPCH的機制。bHLH蛋白SCRM在物理上連接MAPKs和SPCH，並在氣孔譜系分化中發揮直接作用。SCRM具有特異的KRAAM motif與其上游MAPK特異性互作。通過對蛋白結構的精確解剖，揭示了MPK3和MPK6具有明顯的SCRM結合特性，並進一步揭示了這兩個冗餘MAPK之間的功能非冗餘性。該工作為SCRM在氣孔發育過程中作為上游抑制線索和下游激活因子共同作用的機制提供了基礎，並闡述了植物MAPK信號級聯的獨特招募機制。

原文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41477-019-0440-x

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脫落酸（ABA）是調節植物生長，種子休眠，葉片衰老和調控非生物脅迫響應的重要植物激素，在植物體內能被PYR / PYL 家族的ABA受體所識別。擬南芥中PYL家族中含有14個成員，包括PYR1和PYL1-13，其中除了PYL13外，其他所有成員都能響應ABA並以ABA依賴性方式或加強抑制磷酸酶PP2C，導致PP2C結合的SnRK2s激酶被激活。被激活的SnRK2s通過磷酸化調節ABA響應基因表達的轉錄因子如ABA反應元件結合因子（ABF），同時也磷酸化與其他過程相關的底物（見下圖）。

Fig 1. ABA信號通路（Plant Cell Physiol. 2010 Nov; 51(11): 1821–1839.）

PYL是植物中最大的激素受體家族，並且在ABA信號傳導中具有多樣性和冗餘性。 PYL選擇性地與PP2C相互作用並選擇性抑制9個PP2CA的磷酸酶活性。 PYR1和PYL1-2在溶液中是二聚體，而PYL4-6和PYL8-10是單體。通常，在不存在PP2Cs的情況下，單體PYL對ABA具有比二聚體PYL更高的結合親和力，並且這些單體PYL可以在不存在ABA的情況下部分抑制PP2C。

該研究通過對XPO1A轉基因植株蛋白的免疫共沉澱和質譜分析，鑑定了一個富含WD40結構域的蛋白XIW1。在菸草和轉基因材料的實驗表明，LMB（XPO1抑制劑）處理或者對XIW1蛋白NES序列點突變，會促使XIW1在細胞核積累，表明XIW1的出核轉運依賴與XPO1。研究發現，XIW1功能缺失突變體xiw1-1表現為ABA不敏感表型，且ABA處理條件下xiw1中ABI5轉錄和蛋白水平低於野生型；RNA-seq結果表明xiw1-1與abi5有類似的基因表達譜，遺傳學證據表明ABI5介導了XIW1對ABA信號響應的調節。

研究進一步發現，XIW1是一個核質分佈蛋白。擬南芥在正常生長條件下時，XIW1主要定位於細胞質，而ABA處理或者非生物脅迫可促使XIW1在細胞核內聚集。XIW1在細胞核內與ABI5存在直接互作，並起到減緩ABI5降解速率的作用，從而正調節ABA信號途徑。因此，該研究解析了XPO1-XIW1-ABI5信號級聯過程，闡明瞭一種通過蛋白核質轉運調節ABA信號途徑的新機制；同時，過量表達XIW1或者促使XIW1在細胞核內表達，均可提高植物的抗旱性，有一定的應用前景。

華南農業大學生命科學學院研究生徐學中、萬旺和江國彬為該論文的共同第一作者，華南農業大學朱國輝教授和上海逆境生物學研究中心朱健康教授為論文的通訊作者。該工作受到國家自然科學基金的資助。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.molp.2019.07.001

原文鏈接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/pbi.13244

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在該研究中，他們發現與傳統的腺嘌呤鹼基編輯器ABE-P1（含ecTadA- ecTadA*7.10-nSpCas9（D10A）結構）相比，簡化版的腺嘌呤鹼基編輯器ABE-P1S（含ecTadA*7.10-nSpCas9（D10A）結構）的編輯效率有顯著的提升。而且這種提升作用在水稻不同品種（日本晴和Kittaka）中都很明顯。隨著編輯效率的提升，ABE-P1S在某些位點的鹼基編輯窗口也拓寬了。在以前ABE-P1不會產生脫靶編輯的位點，ABE-P1S出現了脫靶編輯（說明可能是效率提升造成的）。

圖1 在水稻中利用ABE-P1S編輯不同靶標

此外，他們發現這種簡化腺嘌呤鹼基編輯提升編輯效率的策略具有普適性，它不僅適用於含SpCas9的腺嘌呤鹼基編輯器（ABE-P1），同時還適用於含SaCas9 (ABE-P2), SaCas9-KKH (ABE-P5)，SpCas9-NG（ABE-NG）的腺嘌呤鹼基編輯器。

這些實驗結果似乎與之前動、植物中報道的結果有些衝突，因為一般認為動、植物細胞中需要額外提供ecTadA分子輔助ecTadA*-nSpCas9（D10A）進行編輯。但是需要注意的是這一推論是基於ecTadA的早期進化版本ecTadA*2.1而得出的，而ecTadA*2.1本身的DNA編輯效率很低。至於ecTadA後期進化版本，尤其是ecTadA*7.10，還沒有實驗檢測過額外提供ecTadA分子是否對ecTadA*7.10-nSpCas9（D10A）編輯效率有很大影響。事實上BiFC實驗表明ecTadA*7.10-nSpCas9 (D10A)可以依靠ecTadA*7.10在植物細胞內能形成二聚體來輔助自己進行脫氨作用。更重要的是ABE-P1S在水稻愈傷和原生質體中的蛋白積累量比ABE-P1要高很多，這就部分解釋了為什麼ABE-P1S在水稻中有更高的編輯效率。因為目前已經有很多研究表明鹼基編輯器的表達量以及核定位效率與編輯效率呈顯著正相關。

有意思是，近日在預印本bioRxiv上， J. Keith Joung團隊發表的文章“CRISPR adenine and cytosine base editors with reduced RNA off-target activities” 中也提到了使用簡化的腺嘌呤鹼基編輯器在不同靶位點的編輯效率與傳統的腺嘌呤鹼基編輯器ABE7.10相當，甚至更高。這些結果說明在真核細胞中，對於ecTadA後期進化版本的ecTadA*7.10而言，並不需要額外的融合ecTadA分子輔助ecTadA*7.10-nSpCas9（D10A）進行編輯。基於這一發現，未來對腺嘌呤鹼基編輯器的改造和優化可能更加方便。

該研究論文的第一作者為上海植物逆境生物學研究中心的華凱博士。工作人員陶小平，碩士研究生梁瑋薏，張朝霞以及南京農業大學實習生勾潤雨均參與了本研究。朱健康研究員為論文的通訊作者。本研究得到了中國科學院的經費支持。

原文鏈接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/pbi.13244

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組蛋白乙酰化對於中和賴氨酸殘基的正電荷和促進染色質鬆弛是重要的；它也是轉錄、DNA複製、組蛋白甲基化和其他組蛋白修飾所必需的。組蛋白由乙酰轉移酶乙酰化，乙酰基從乙酰輔酶A轉移到組蛋白賴氨酸殘基.

乙酰輔酶A是一種中央代謝物，可通過多種代謝途徑產生，涉及丙酮酸、檸檬酸、乙酸和脂肪酸β-氧化代謝。在哺乳動物中，線粒體中的乙酰輔酶A是通過不同途徑產生的，包括脂肪酸β氧化。在胞漿和細胞核中，三磷酸腺苷(ATP)-檸檬酸裂解酶(ACLY)切割出從線粒體輸出的檸檬酸，再生乙酰輔酶A，可用於其他生物合成過程，如脂肪酸合成和組蛋白乙酰化。在小鼠中，肉鹼棕櫚酰基轉移酶1A(CpT1A)的條件性丟失是將脂肪酸轉移到線粒體進行β氧化所必需的，它以ACLY依賴的方式通過組蛋白乙酰化作用損害真皮淋巴的形成。丙酮酸脫氫酶複合物可以在一定條件下(從線粒體轉移到細胞核，產生乙酰輔酶A，介導哺乳動物細胞組蛋白乙酰化。在擬南芥中，胞質乙酰輔酶A羧化酶(ACC 1)的突變，將胞漿乙酰輔酶A轉化為丙二酰輔酶A，以延長胞漿產生的脂肪酸，導致胞漿乙酰輔酶A的大量積累，特別是導致H3K27乙酰化(H3K27ac)。

這些結果強調了乙酰輔酶A在哺乳動物和植物細胞核組蛋白乙酰化中的重要性。然而，在植物細胞中，質體、線粒體、過氧化物酶體和胞漿都能產生乙酰輔酶A。植物細胞器代謝的損傷是否會影響核表觀遺傳修飾仍有待解決。

在這裡，研究人員發現過氧化物酶體中β-氧化的缺陷影響核中的組蛋白乙酰化和DNA甲基化。該研究工作為來自過氧化物酶體的逆行信號傳導提供了證據，以調節高等真核生物中的核表觀遺傳修飾。

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在該研究中，研究者使用穩定的轉基因品系來評估xCas9和SpCas9-NG在水稻中進行基因編輯和鹼基編輯的效率。研究發現，xCas9可以在水稻中利用NG和GAT PAM序列在靶位點有效誘導突變。但是，包含xCas9的鹼基編輯器無法編輯大多數測試的目標站點。

圖. xCas9和SpCas9-NG變體在水稻中等基因突變效率

另一方面，SpCas9-NG在具有各種NG PAM的位點表現出強大的編輯活性，而在NG後沒有顯示對第三核苷酸的任何偏好。此外，該研究還顯示xCas9和SpCas9-NG在CGG PAM位點具有比SpCas9更高的特異性。並且還證明含有SpCas9-NG的不同形式的胞嘧啶或腺嘌呤鹼基編輯器可以在水稻中有效地工作，具有更廣泛的PAM兼容性。因此，該研究產生了多種基因組工程工具，將大大擴展水稻和其他作物的目標範圍。

論文鏈接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1674205219301224

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在植物中，DNA的胞嘧啶甲基化發生在三種不同的環境中：CG，CHG和CHH（其中H代表A，T或C）。在擬南芥中，DRM1和DRM2通過RNA指導的DNA甲基化（RdDM）途徑催化從頭CHH甲基化。在DNA複製過程中由MET1維持CG甲基化，而植物特異性DNA甲基轉移酶CMT3維持CHG甲基化。通過一系列雙功能DNA糖基化酶/裂解酶：ROS1（DML1），DME，DML2和DML3實現活性DNA去甲基化。除去甲基化的胞嘧啶鹼基並隨後進行骨架切割後，通過鹼基切除修復（BER）過程用未甲基化的胞嘧啶填充胞嘧啶間隙，其包括幾種組分，包括ZDP，APE1L和LIG1。儘管啟動子DNA甲基化通常對下游基因具有有害作用，但最近的研究表明，幾種擬南芥Su（var）3-9同源物SUVH1和SUVH3通過與三個含DNAJ結構域的同源物（SDJ1，SDJ2和SDJ3）相互作用而與甲基化啟動子序列結合。促進轉錄激活。

由於SUC2轉基因沉默，兩種突變體在含1％蔗糖的培養基上顯示出長根表型

研究人員使用正向篩選來分離XPO1A (擬南芥中的核輸出受體)，作為一種抗沉默因子，保護轉基因免受轉錄沉默。XPO1A功能的喪失導致轉基因啟動子和一些內源基因座的基因座特異性DNA甲基化。研究人員發現xpo1a在體內直接與組蛋白去乙酰化酶HDA6相互作用，XPO1A突變導致HDA6蛋白的核保留增加，並導致組蛋白乙酰化減少和轉基因沉默增強。

研究結果揭示了一種新的表觀遺傳調節機制，通過調節染色質調節劑的XPO1A依賴性核-細胞質分配。

參考信息：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/jipb.12787

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糜子（broomcorn millet，Panicum miliaceum L.），又稱黍、稷、禾祭、糜，是我國最早馴化利用的作物之一，其種植歷史最早可追溯到10000—8000年前，大約在3000年前傳播到歐洲和世界各地。在禾穀類糧食作物中，糜子是生產單位重量籽粒的需水量最低的。隨著全球水資源危機日益嚴重，糜子高效的水分利用效率可為人類未來糧食安全提供保障。

研究人員結合全基因組三代PacBio測序、二代illumina測序、HiC、以及高密度遺傳連鎖圖譜構建技術，獲得了糜子基因組18條染色體精細圖譜，其總長度為855Mb；註釋得到了55,930個蛋白編碼基因，其中99.3%的基因可定位在染色體上。糜子為異源四倍體，起源於進化距離約560萬年的兩個親本基因組的融合。此外，黍族特異的E3泛素連接酶亞家族的擴增可能在糜子的適應性進化中發揮重要作用。

經典的C4光合作用研究將C4途徑分為三種亞型：依賴NADP的蘋果酸酶型(NADP-ME型)、依賴NAD的蘋果酸酶型(NAD-ME型)、具有PEP羧激酶的天冬氨酸型(PEP-CK型)。近年來研究傾向於認為PEP-CK型無法獨立存在，而是依賴於NADP-ME型或NAD-ME型而存在。糜子屬於經典的NAD-ME型C4作物。通過糜子與其它作物基因組的比較和轉錄組分析發現，糜子基因組中NADP-ME型和NAD-ME型相關的酶和轉運蛋白不但同時存在，而且在光合作用組織中維持較高的表達水平。研究人員認為C4途徑三種亞型可能同時存在於糜子中，這種機制可能有助於糜子更好的應對田間環境的的動態變化。

該研究由中國科學院上海植物逆境生物學研究中心聯合美國內布拉斯加大學、西北農林科技大學等國內外研究單位共同完成，鄒長松（現為河南大學棉花生物學國家重點實驗室教授）是該文章的第一作者，張蘅和朱健康為共同通訊作者。該工作得到了中國科學院、上海市科委等經費的資助。

值得一提的是，在同一天，中國農業大學賴錦盛教授團隊在Nature Communications上發表了題為Chromosome conformation capture resolved near complete genome assembly of broomcorn millet 的研究論文，也報道了高質量的糜子基因組序列。

原文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41467-019-08409-5

https://www.nature.com/articles/s41467-018-07876-6

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第一：基因編輯植物是否是轉基因植物？

這是基因編輯作物是否能順利進入田間種植的關鍵所在。美國農業部（USDA）已經確定了基因編輯的作物免於轉基因作物的監管，但是去年歐盟最高法院最終規定基因編輯的作物應遵守與傳統轉基因生物相同的嚴格法規，這一決定對包括科學家在內的基因編輯作物的支持者來說是一個重大挫折。因此，該綜述指出隨著基因編輯工具的出現，需要重新考慮轉基因生物的當前定義和相應的調控框架，因為通過基因編輯方法實現的基因組修飾與轉基因技術的基因組修飾非常不同。

文章指出原因有二：首先，大多數CRISPR誘導的基因突變是小插入缺失而不是大片段插入或重排。而這種小的插入缺失變異通常也存在自然條件下生長的植物中，或使用輻射或化學誘變劑大規模誘導的植物中。其次，傳統轉基因植物中轉基因是穩定遺傳，而使用CRISPR和其他基因編輯工具構建的性狀改良植物可以是無轉基因的。因此，文章認為，無轉基因編輯的植物應該採用與傳統化學或輻射誘變培育的植物相同的方式進行處理，不應受到特殊的管理政策的約束。

第二：脫靶活性是否需要關注？

之前研究應用全基因組測序來檢測了擬南芥，水稻和番茄等植物中的脫靶突變時，發現非常有限的脫靶效應。並且隨著技術改進，更有可能避免脫靶活性。該文指出與醫學應用相比，CRISPR系統在植物育種中應用的脫靶活性應較少受到關注。

文章指出原因是基因編輯工具應用於作物育種，脫靶突變可能具有負面影響，無影響（中性）或對農藝性狀的正面影響。而具有負效應突變的植物在育種/選擇過程中被丟棄。然而，如果脫靶突變對性狀具有中性或正面影響，它們可以保留在新繁殖的品系中。正如使用物理和化學誘變劑的傳統育種一樣，也不需要關注任何脫靶效應。

第一：如何將基因編輯系統遞送到植物生殖/再生細胞中？

1.農桿菌浸花轉化法

2.愈傷組織農桿菌和基因槍轉化法

3. ribonucleoproteins (RNPs)轉化法

第二：如何將基因編輯工具遞送到不可轉化的植物中？

1.納米顆粒(NP)遞送法

第三：如何高效地進行多個位點的基因編輯？

圖. Multiplex gene editing systems in plants.

第四：如何在植物中進行精確單鹼基/片段的基因編輯？

圖. Precise gene editing using CRISPR systems.

文章還總結了，目前所有基於CRISPR的植物精確基因編輯和植物鹼基編輯系統，並指出了各個系統的基本信息及編輯效率等（見下圖）

1.植物基因敲入系統：

論文鏈接：

https://academic.oup.com/nsr/advance-article/doi/10.1093/nsr/nwz005/5290356

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該研究通過整合分析五個成熟時期柑橘全基因組DNA甲基化和轉錄組數據(A)，發現柑橘成熟過程中DNA甲基化水平與番茄成熟過程DNA甲基化水平呈現相反的變化趨勢。這種全基因組DNA甲基化水平的上調(B, C)與DNA去甲基化酶基因表達的下調呈相關性(D)。

由此研究者猜測柑橘成熟過程中DNA甲基化水平的上調可能對基因表達和成熟過程十分重要。研究者發現對成熟的綠果時期的果實進行DNA甲基化抑制劑的處理能夠阻礙柑橘成熟進程(E)，這說明DNA甲基化的上調對於柑橘正常成熟十分重要；結合轉錄組數據，發現可能受DNA甲基化調控的基因中有1,113個上調基因、950個下調基因和3,119個沒有差異表達的基因。進一步研究發現表達有差異的基因與DNA甲基化的變化有很強的相關性，而表達沒有差異的基因與DNA甲基化的變化不存在強相關性(F,G,H)。

通過GO功能分析發現，被甲基化調控的差異表達基因對果實成熟過程十分重要，例如參與光合作用，以及ABA合成及其信號響應等基因。進一步分析柑橘果實的小RNA水平，發現甲基化變化區域有明顯的小RNA的富集，因此這些區域的甲基化形成與RNA介導的DNA甲基化通路相關(I)。綜上，該研究以柑橘為研究對象，第一次發現了果實成熟過程中的DNA 甲基化上調現象，並解釋了 DNA甲基化修飾對成熟相關基因的表達調控以及柑橘的果實成熟有重要意義。

參考信息：

https://www.pnas.org/content/116/4/1430.long

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在本項研究中，研究人員首先通過DNA affinity trapping篩選偏好於與甲基化MEMS序列結合的蛋白，發現了SUVH1和SUVH3兩個候選蛋白。利用CRISPR/Cas9技術獲得了suvh1/3雙突，並進一步將另外兩個同源蛋白SUVH7和SUVH8同時突變，獲得suvh1/3/7/8四突。

通過分析發現SUVHs不僅對外源35S啟動子驅動的SUC2和HPTII基因表達是必需的，同時對一些內源的基因的表達也起促進作用。在suvhs雙突變體和四突變體，ROS1基因表達進一步降低，同時伴隨著基因組許多位點的甲基化水平升高。EMSA試驗發現，SUVH3蛋白體外結合甲基化的MEMS。另外，ChIP試驗發現SUVH3蛋白在擬南芥也可以體內結合ROS1基因啟動子的MEMS序列，並且富集程度受MEMS甲基化水平調控。

這些證據說明SUVHs蛋白直接結合ROS1基因啟動子的MEMS序列並促進ROS1基因表達。此外，通過IP-MS分析發現了3個與SUVH3相互作用的DNAJ蛋白，並且出現在DNA affinity trapping候選蛋白中，表明SUVHs與DNAJs共同作用調控ROS1基因轉錄。這項研究揭示了SUVHs以依賴於DNA甲基化的方式結合ROS1啟動子的甲基化感應元件，來調節ROS1基因轉錄及DNA甲基化的機制。

參考信息：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/jipb.12768

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2019年4月22日，New Phytologis雜誌在線發表了來自中科院上海植物逆境生物學研究中心朱健康課題組題為“Arabinose biosynthesis is critical for salt stress tolerance in Arabidopsis“的研究論文。

L-阿拉伯糖（Ara）是植物特異性單糖，其存在於擬南芥中10-20％的非纖維素細胞壁多糖中。Ara存在於阿拉伯聚糖和I型阿拉伯半乳聚糖中，它們是果膠壁的主要成分。除了多糖，許多糖蛋白，例如伸展蛋白和富含亮氨酸的重複伸展蛋白，及一些分泌的CLE肽和普遍存在的阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGP）也是阿拉伯糖基化的。

Ara有兩種環形式，即呋喃糖（Araf）和吡喃糖（Arap）形式。在植物中Ara以Araf形式存在。然而，Ara最初通過de novo途徑或通過補救途徑合成為UDP-Arap的形式，然後UDP-Arap在胞質溶膠中轉化為UDP-Araf。UDP-Arap的從頭合成是由UDP-Glc脫氫酶（UGD）催化的UDP-Glc至UDP-葡糖醛酸，之後UDP-葡糖醛酸脫羧酶（UXS）隨後催化UDP-GlcA轉化為UDP-木糖。之後UDP-Xyl-4-差向異構酶（UXE）催化 UDP-Xyl向UDP-Arap的轉化、之後在UDP-Ara變位酶的作用下將合成的UDP-Arap轉化為UDP-Araf。

在這項研究中，通過對擬南芥中對鹽脅迫過敏的突變體進行了遺傳篩選，鑑定了幾種在鹽脅迫下表現出根伸長異常的突變體。其中一種突變體就是UDP-D-木糖-4-差向異構酶1（UXE1）基因（MUR4）被突變，導致在高濃度的NaCl，KCl，NaNO3或KNO3下根伸長減少（如下圖）。

進一步研究表明，UDP-Ara生物合成所需的MUR4基因突變導致鹽脅迫下的根伸長減少的表型可以通過應用外源Ara來恢復，進一步證實由於Ara的水平的降低會導致對鹽敏感。同時，在鹽脅迫下，MUR4基因的突變導致細胞-細胞粘附異常（見下圖）。此外，該研究證明了MUR4的三個旁系同源物MURL，DUR，MEE25也有助於UDP-Ara的生物合成，並且對於維持擬南芥的根伸長是必需的。

綜上，該工作揭示了Ara代謝在鹽脅迫耐受中的重要性，並且還提供了對植物中UDP-Ara生物合成所涉及的酶的新見解。

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2019年4月8日，Plant Biotechnology Journal在線發表了上海植物逆境生物學研究中心朱健康實驗室題為“Optimizing Base Editors for Improved Efficiency and Expanded Editing Scope in Rice”的研究論文。該工作升級了水稻之前應用的CBE和ABE鹼基編輯器，不但大幅提高了效率，而且擴大了鹼基編輯的序列選擇範圍。

單鹼基編輯技術（Base editing）是基於CRISPR系統拓展出來的新型靶基因定點修飾技術，能夠在不引入DNA雙鏈斷裂（DSB）也不需要重組修復模板的情況下實現更加高效、精準的單鹼基水平修飾。目前開發成功的鹼基編輯器主要包括CBE和ABE兩套系統，可以在一定的序列窗口範圍內實現C/G->T/A或A/T->G/C的鹼基轉換，已成功應用於許多植物物種如水稻，小麥，玉米，番茄，擬南芥和甘藍型油菜等等。然而目前的鹼基編輯器在植物上應用的總體效率仍然不高，序列選擇範圍也受制於少數幾類PAM基序，尋求高效的單鹼基編輯技術一直以來是植物生物技術研究的熱點和難點。

上一年，David Liu研究組通過

朱健康實驗室基於原有的植物CBE體系引入了David Liu優化的元件尤其是重構的Anc689脫氨酶，在水稻中測試發現鹼基編輯的效率得到了大幅提高，在NRT1.1B、SLR1和ALS三個位點實現預期鹼基替換的效率均達到70%-80%，而且所產生的突變體大多數為純合或Bi-allele類型突變。在此基礎上研究人員進一步引入了Osamu Nureki最近開發的Cas9-NG進化蛋白，利用其可以識別NG PAM的特性擴大了CBE鹼基編輯的序列選擇範圍，在水稻中成功實現了先前利用NGG作為PAM基序無法實現的對兩個除草劑靶標酶ALS和EPSPS的精確修飾並獲得了抗除草劑的植株。基於類似的策略，研究人員把原有的ABE鹼基編輯器也升級為ABEmax，測試表明ABEmax同樣提高了效率並且能以非典型NGG作為PAM基序進行鹼基編輯。但是相對於CBEmax，ABEmax的效率仍有進一步提升的空間。

該研究為水稻基因編輯和精確育種提供了一個新的利器。值得一提的是，該論文向Plant Biotechnology Journal投稿的時間為1月22日，投稿時間均早於不久之前在Molecular Plant同時在線發表的三篇關於利用xCas9和Cas9NG在植物中拓展基因敲除和鹼基編輯的論文。

原文鏈接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13124

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植物在其整個生命週期中都會遇到各種不利的環境條件。冷脅迫（包括低溫（0–15°C）和冷凍（<0°C）是一種非生物脅迫，極大地限制了植物的生長和農業生產力。許多溫帶植物通過稱為冷馴化的過程，能夠在低溫，非冰凍條件下暴露後提高其抗凍性。冷馴化涉及大規模的基因表達變化和代謝改變。對冷應答基因的分析導致發現三個名為CBF1，CBF2和CBF3的C-重複結合因子（CBF）基因。在冷脅迫下，這三個CBF基因的轉錄水平被迅速誘導。CBF1，CBF2或CBF3基因的組成型過表達增加了許多冷應答（COR）基因的表達，包括COR15，COR47，COR78和KIN1，隨後增加了擬南芥的耐凍性。同時突變這三個CBF基因會減弱COR基因的轉錄水平，並導致對冰凍過敏。低溫脅迫下這三個CBF基因的表達受幾個上游轉錄因子的調控，包括EIN3，MYB15，CAMTA和ICE1。乾旱和鹽是另外兩個對植物的生長髮育產生不利影響的非生物脅迫因素。據報道，許多基因，例如RD29A和RD29B，通常是由乾旱，高鹽和寒冷脅迫誘導的，而某些基因是在特定的非生物脅迫條件下誘導的。

PICKLE（PKL）是ATP依賴的染色質重塑劑的Mi-2 / CHD3亞家族的組成部分。染色質重塑因子是利用ATP水解產生的能量來改變核小體和染色質構象所必需的。已確定PKL可以調節許多植物發育過程，包括胚形態發生過程中的胚胎髮育，種子萌發，根分生組織活性和下胚軸細胞伸長。在許多發育過程中，CHD3型染色質重塑因子參與轉錄共激活，但PKL蛋白在擬南芥中起轉錄抑制因子的作用。PKL蛋白具有核小體重塑活性，參與組蛋白H3賴氨酸27（H3K27me3）的三甲基化，H3K27是與組織特異性基因的調控有關的抑制性組蛋白標記。在之前的研究中，研究人員發現PKL參與了RNA介導的DNA甲基化（RdDM）途徑。PKL基因的突變導致嚴重的發育表型，包括小而捲曲的葉子和長角果。根據對pkl-1突變體中DNA甲基化組，小RNA和轉錄組的分析結果

一些研究表明，RdDM途徑的破壞導致非生物脅迫響應的缺陷。例如，RdDM途徑中涉及的RDM4基因突變導致擬南芥對冷脅迫的敏感性增加。RDM4通過CBF依賴性途徑調節COR基因的表達。據報道，pkl突變體對脫落酸（ABA）的種子萌發非常敏感，這是由ABI3和ABI5基因轉錄水平的組成水平升高引起的。到目前為止，人們對PKL在應對其他非生物脅迫（例如寒冷和鹽鹼度）的反應中的作用仍知之甚少，而PKL在非生物脅迫耐受性中調控作用的潛在機制仍不清楚。

在這項研究中，研究人員提供了PKL在耐寒和耐鹽脅迫中的作用的證據。 PKL基因的破壞導致對冷和冰凍過敏，這與某些冷應答基因的轉錄丰度改變有關。 低溫處理的野生型植物和pkl突變體的轉錄組分析顯示，PKL通過調節CBF3基因的表達來調節某些COR基因的表達。 總之，該研究研究確立了PKL在冷應答基因調控和耐寒性中的遺傳作用。 此外，研究數據還支持PKL在調節鹽脅迫反應中的積極作用。

參考消息：

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2019.00900/full

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