朋友們~本週CRISPR/Cas技術再次迎來重大突破！
我們知道，CRISPR/Cas技術雖然已在短短几年內成為目前最好用的基因編輯工具之一，但是實際上它的應用還要受到特定基因序列的限制，這就意味著
它並不能夠隨我們所欲地編輯所有的基因片段。而一項最新的研究則完全放開了CRISPR/Cas的束縛，現在“基因魔剪”可以說是真的“想剪哪裡剪哪裡啦”！
這項新研究提出了兩種人工改造的Cas酶，SpG和SpRY，其中SpRY幾乎可以不受限制地對全部序列具有編輯活性。這意味著我們能夠對以前根本無法涉及的致病突變進行修改，基因編輯能為人類做的貢獻大大增加了[1]！這項研究發表在《科學》雜誌上，通訊作者是來自麻省總醫院的Benjamin P. Kleinstiver。
圖源 | pixabay
我們都知道，CRISPR/Cas系統原本是原核生物的一種自我保衛機制，CRISPR/Cas的存在能夠讓原核生物避免外源遺傳物質的入侵。除了作為識別重點的CRISPR序列，其實還有另外一個重要的序列，原間隔序列臨近基序（PAM）。簡單來說，沒有對應的PAM，就啟動不了CRISPR/Cas系統。
PAM根據Cas酶的種類不同而有所不同，目前使用最廣泛的、來自化膿鏈球菌的SpCas9，主要識別的是NGG序列。
很顯然，僅能識別NGG是不足以滿足對所有序列編輯的需求的。
對蛋白來說，結構決定功能。SpCas9識別NGG，主要是通過R1333和R1335兩個位置氨基酸側鏈和鳥嘌呤的結合[2]，那麼我們是不是可以通過替換氨基酸來讓SpCas9識別其他的PAM序列呢？
關鍵在R1333和R1335
其實已經有很多科學家嘗試過利用分子進化的方法，改變PAM作用域中的氨基酸來改變Cas酶的PAM偏好。比如我們之前也介紹過的劉如謙的xCas9，就是通過噬菌體輔助持續進化器（PACE）來製造大批量的突變，從中篩選出PAM適應更廣的Cas酶。
順便一提，xCas9的戰績是適用性擴大了4倍。
而今天介紹的研究，則是採用了另一種思路，結構導向工程（structure-guided engineering），精確地對個別氨基酸序列進行替換，以獲得想要的蛋白性狀。
為了一步步擴大SpCas9的PAM適用範圍，研究者們決定先搞出一個能夠識別NGN的1.0版本來。
科研經驗告訴學者們，識別PAM的關鍵就在於某個或某幾個氨基酸殘基[3]。通過比對SpCas9-VQR、SpCas9-VRQR等前人開發的變體和它們識別的PAM序列，研究者們很快提出了幾個可能的氨基酸取代方案。為了測試這些變體的活性，研究者們還開發了一種高通量測試PAM活性的方法（HT-PAMDA）來分析變體對PAM的偏好。
最終，在各種氨基酸取代組合方案裡，研究者們獲得了一種能夠基本等效識別NGA、NGC、 NGG、NGT的變體，它具有五個氨基酸取代（D1135L/S1136W/G1218K/E1219Q/R1335Q/T1337R），被命名為SpG。
通過在人類細胞中進行的編輯測試，我們可以看到，SpG對NGN可實現基本等效識別，且效率要比SpCas9以及其他的變體更高。進一步實驗顯示，SpG對NGG的編輯活性達到51.2%，其他三類則達到了53.7%。
此外，SpG也適用於單鹼基編輯器（BE）。
SpG可識別NGN，且活性更高
好，接下來繼續擴大PAM範圍。搞定了NGN，現在把NAN也加上，試試NRN（R即A+G）。
這一次，研究者們瞄準的是R1333位可能與腺嘌呤產生的化學反應。HT-PAMDA測試出來的結果顯示，把R1333位置替換成丙氨酸、半胱氨酸或脯氨酸就可以有效識別NRN了。
經過一系列細化和篩選，最終研究者們得到的是在SpG（L1111R/A1322R）基礎上，增加R1333P、A61R、N1317R的2.0版，SpRY。
為什麼叫SpRY呢？
雖然在NGN上，SpRY活性不如SpG，不過SpRY同樣能夠有效識別NAN，NRN成立。比較驚喜的是，SpRY同樣能夠識別NYN（Y即C+T）。在實驗中，全部31個NYN位點，SpRY編輯效率高於20%的有13個（42%），當然，普通的SpCas9是一個也做不到的。
鑑於對NRN的識別活性比NYN更高，大約是一倍，SpRY就叫做SpRY了。
與SpG同樣，SpRY也適用於單鹼基編輯。
SpRY可識別幾乎全部PAM
不言而喻，SpG和SpRY大大擴大了CRISPR/Cas系統的極限，幾乎整個基因組都“觸手可及”了！
另外，根據實驗數據，SpG和SpRY的脫靶效應與SpCas9水平接近，新增的脫靶問題主要來源於擴展大的PAM範圍，而另外一種HF1變體則能夠消除這類脫靶並提升編輯效率。
說不定我們還可以期待一下3.0版本呢！
全體奇點糕嘔心瀝血嘔心瀝血嘔心瀝血打造的重磅音頻課程《醫學趨勢50講》終於上線了。我們一口氣幫你同步了全球醫學前沿領域最重磅的進展。只需500分鐘，讓你徹底搞懂最重磅的醫學前沿進展。
課程亮點如下：
1、全面：一網打盡最重磅的醫學前沿進展。
在這套《醫學趨勢50講》中，我們囊括了免疫治療、幹細胞、微生物、人工智能、二代測序，抗癌新藥研發等15個重要的前沿領域，幫你將全球最頂尖的科研成果一舉收入囊中。
2、緊跟趨勢：幫你無縫同步全球認知。
奇點跨學科專業知識團隊，依靠強大的自有數據庫系統，每天跟蹤全球3000多本醫學與生命科學領域的重要期刊，實時把握醫學前沿科技最強勁的脈搏。和全球認知同步，你不需要費心費力，我們把全球脈動送到你的耳邊。
3、有趣易懂：不用絞盡腦汁，就能理解全球醫學頂尖難題。
醫學和生命科學領域的論文往往晦澀難懂，再加上語言的隔閡，導致很多人對此望而卻步。這一次，我們幫你把艱深晦澀的前沿學術調製成清新爽口的科學小品，讓你在享受科學之美的同時，輕輕鬆鬆理解醫學頂尖難題。和全球最聰明的大腦思考同樣的問題，你也可以。
[1]https://science.sciencemag.org/content/early/2020/03/25/science.aba8853
[2]. C. Anders, O. Niewoehner, A. Duerst, M. Jinek, Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature 513, 569–573 (2014). doi:10.1038/nature13579 Medline
[3]B. P. Kleinstiver, M. S. Prew, S. Q. Tsai, V. V. Topkar, N. T. Nguyen, Z. Zheng, A. P. W. Gonzales, Z. Li, R. T. Peterson, J.-R. J. Yeh, M. J. Aryee, J. K. Joung, Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature 523, 481–485 (2015). doi:10.1038/nature14592 Medline
本文作者 | 代絲雨
閱讀更多 奇點網 的文章
