【Nature論文拆解】外泌體作為“誘彈”中和細菌毒素

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撰稿專家 | 劉楊副教授(浙江大學)

點評專家 | 張博士(自噬領域)

蔡教授(外泌體領域)

文獻概述

一、研究背景介紹

我們都知道病原體之所以致病通常是因為進化出了應對宿主防禦系統的“逃逸”機制。而機體在面對病原微生物入侵,也會產生“清除”和“逃逸”兩種防禦機制。大部分研究聚焦於機體的“清除”機制,而“逃逸”機制鮮有報道。

詳見上一期文章

【Nature/Cell host& microbe】連續性研究——病原體應對宿主防禦系統的“逃逸機制”

二、文章亮點

首次報道細胞通過分泌表達細菌毒素受體的外泌體(Exosome)作為“誘彈”吸附中和細菌毒素,逃脫細菌毒素攻擊,並減少造成的損傷;

通過阻斷自噬溶酶體形成的不同階段對ADAM10的表達和分佈及外泌體產生,發揮不同的影響。

專家點評

可借鑑之處和主要發現:

難能可貴的是本文的立項線索並不突出,因為看起來該團隊2015年的Cell子刊已經把工作基本做完了,ATG16L1 KD 增加了α-toxin對內皮細胞的毒性,基於ADAM10是金葡菌α-toxin的受體,檢測發現ATG16L1 KD導致內皮細胞的ADAM10蛋白水平升高,合乎邏輯也順理成章。除了“ATG16L1 KD是如何導致內皮細胞的ADAM10蛋白水平升高”的這一問題,而蛋白水平升高但mRNA沒有差異,相比對照組,敲減細胞的exosome上該蛋白並無富集(exosome膜和細胞膜上同高同低,也就不會有誘彈的作用),總蛋白又和膜表達同時增加(基本排除了漿-膜轉運機制和膜外蛋白酶切割消耗的影響),剩下最可能的就是microRNA等對其蛋白翻譯的調節、泛素化降解等食之無味的機制,大部分團隊就會到此為止了。

但是該團隊“小題大做”做出了這篇Nature主刊的論文。他們堅持對自噬形成的各個階段阻斷檢測對外泌體分泌和ADAM10富集的影響,結果發現阻斷溶酶體酸化,抑制自噬溶酶體形成,可降低細胞膜ADAM10表達,同時增加exosome的分泌,更重要的是增加ADAM10在exosome上的表達,進一步發現細菌DNA可通過TLR9促進exosome分泌並抑制溶酶體酸化。在細菌靜脈注射的菌血症模型裡,主要是誘導肝細胞增加分泌exosome,而注射exosome顯著減少了菌血症造成的致死。

圖片解析

因為本文主要工作是對自噬的各階段的阻斷檢測對外泌體分泌和ADAM10富集的影響,譯者簡單地DIY了一張阻斷的示意圖,並簡述自噬的進程,以幫助對自噬不太熟悉的讀者更好的理解本文。

自噬是一個多步驟的動態過程, 包括誘導、 成核、 延伸、 自噬體形成、 自噬體可以和晚期內體/多囊泡體融合形成自噬內涵體(可產生secretory autophagy,運輸無分泌信號肽的蛋白到胞外,和影響外泌體分泌),並和溶酶體融合形成自噬溶酶體形成(經典的自噬),下圖的紅色X代表作者分別阻斷的位置:

Fig 1

問題:ATG16L1對ADAM10表達的抑制是否是溶酶體和/或蛋白酶體依賴的?

實驗驗證:

ATG16L1 KD A549細胞的ADAM10的膜表達(Fig1a,b)和總蛋白(Fig1c,d)都顯著升高,且和敲除ATG16L1的上游激酶ULK1或結合蛋白ATG5效應一致(Fig1f);ATG16L1 KD A549細胞抵抗α-toxin介導的細胞損傷(Fig1e);而溶酶體酸化抑制劑 (NH4Cl, chloroquine or bafilomycin)造成膜ADAM10表達下調(Fig1g,h);蛋白酶抑制劑MG132也不影響ADAM10的表達水平(FigS1h,i)。

(Fig 1)

(FigS1h,i)

結論:ATG16L1對ADAM10表達的抑制與溶酶體和蛋白酶體無關。

Fig2

問題: ATG16L1 KD抑制自噬體形成是否會進一步影響ADAM10在外泌體上的表達?

實驗驗證:

ATG16L1 KD造成外泌體的ADAM10蛋白減少(Fig2a,b),但這是因為外泌體分泌減少所致(Fig2c-f),而不影響單個外泌體上的ADAM10表達量(Fig2g);KD小鼠血清中的外泌體也顯著下降(Fig2h)。

結論:抑制自噬體形成可減少外泌體的分泌,但不影響外泌體上的ADAM10表達水平。

專家推理:這可能是通過影響了多囊泡體的釋放。

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問題:阻斷自噬體和溶酶體的融合是否影響ADAM10在細胞膜上的表達?

實驗驗證:

敲除自噬體和溶酶體的融合的關鍵蛋白STX17(不影響自噬內涵體和溶酶體的融合)導致ADAM10總蛋白水平增加,但不影響細胞膜上的ADAM10表達水平(Fig2j,k),而外泌體的分泌量顯著增加(Fig2i)。

結論:阻斷自噬溶酶體的形成增加ADAM10總蛋白水平。

專家推理: 這可能和減少的自噬降解相關,但不影響細胞膜上的ADAM10表達。而增加的外泌體的產生,可能是因為阻斷了經典自噬溶酶體的形成,導致自噬進程向分泌自噬這條非經典途徑轉向,間接促進了多囊泡體和自噬內涵體的胞外釋放。

Fig3

問題:細菌成分是否會影響自噬相關外泌體產生?

實驗驗證:

細胞感染實驗發現四種細菌(金葡菌、肺炎鏈球菌、檸檬酸桿菌和傷寒沙門氏菌)都顯著的促進外泌體的分泌(Fig3a);而這個效應是細菌DNA作用於TLR9介導的(Fig3b,c),同時TLR9信號可影響溶酶體酸化(FigS5a-c);而通過mTOR抑制劑Torin-1活化自噬不能誘導外泌體分泌的額增加(FigS4k,l)。但GE4869干擾多囊泡體出芽產生外泌體可顯著減少TLR9信號誘導的外泌體釋放(FigS4m);靜脈注射構建的菌血症小鼠模型發現血清中外泌體主要來自於肝臟細胞,而不是巨噬和樹突狀細胞(Fig3d-h)。

(Fig3)

(FigS5a-c)

(FigS4k,l,m)

結論:細菌DNA刺激的TLR9信號介導的外泌體分泌不依賴於自噬的發生,細菌DNA可以通過內體上表達的TLR9促進肝臟細胞分泌外泌體。

Fig2i

問題:TLR9信號抑制的溶酶體酸化是否是其誘導外泌體高表達的機制?

實驗驗證:溶酶體抑制劑chloroquine or bafilomycin處理不僅增加了外泌體的釋放,而且導致外泌體高表達ADAM10蛋白(Fig2i和FigS3a-d)。

(Fig2i)

(FigS3a-d)

結論:細菌DNA刺激的TLR9信號,通過影響溶酶體酸化促進外泌體的釋放,而且導致外泌體高表達ADAM10蛋白。

專家推理:其可能的原因是阻斷自噬溶酶體的形成增加ADAM10總蛋白水平,同時導致自噬進程向分泌自噬這條非經典途徑轉向,間接促進了多囊泡體和自噬內涵體的胞外釋放。溶酶體抑制劑促進,而STX17 KD不影響外泌體上的ADAM10表達的區別可能在於STX17不影響自噬內涵體和溶酶體的融合,而溶酶體抑制劑抑制自噬內涵體和溶酶體的融合,這不僅促進了自噬進程向分泌自噬這條非經典途徑轉向,間接促進了多囊泡體和自噬內涵體的胞外釋放,同時減少了自噬內涵體裡ADAM10的降解。

Fig4

問題:ADAM10陽性的外泌體是否可為機體提供保護?

ADAM10陽性的外泌體保護細胞免受金葡菌α-toxin的損傷(Fig4a,b);因為其可以吸附α-toxin,並使其從寡聚化解離成單體狀態(Fig4c),同時提高菌血症小鼠存活率(Fig4g-j)。巨噬細胞和A549細胞來源的外泌體也可分別中和LukED和diphtheria毒素(Fig4d-f)。

特邀專家點評

專家1:張建賓博士

浙江省人民醫院副研究員,浙江省傑青、錢江人才。畢業於新加坡國立大學Yong Loo Lin醫學院,獲博士學位。從事自噬領域研究十餘年,在國際知名期刊Autophagy、Nat Protocol、ACS Cen Sci、Cell Res、Med Res Rev等發表多篇自噬領域相關論文。

細胞自噬發生過程分為早期階段(自噬泡形成)、晚期階段(自噬泡與溶酶體融合、溶酶體降解自噬泡內容物)。作者首先探討自噬早期階段對外泌體分泌和ADAM10富集的影響,結果發現干擾自噬相關基因ATG5、ATG16L1、ATG7、ULK1等表達後,exosome形成數量減少,降解ADAM10能力降低,引起細胞膜ADAM10表達顯著升高。但是在自噬晚期階段,觀察到相反現象,無論使用si-STX17抑制自噬泡與溶酶體融合,還是使用溶酶體抑制劑,都促進大量exsome形成,降解ADAM10能力增加,引起細胞膜ADAM10表達顯著減少。但是,我們也發現一些不足之處,使用RNA干擾手段或化學藥物調控細胞自噬水平,兩者作用機制不同,實驗結果也會有所差異。在STX17干擾後的細胞內,我們發現細胞膜ADAM10表達水平升高(見j圖),意味著以自噬溶酶體方式降解ADAM10的能力下降,儘管作者結果顯示exsome的形成數量顯著增加。此外,自噬抑制劑CQ或BAF處理細胞時間較長,細胞活力可能受到影響,這也間接影響細胞內exsome形成。在功能方面,干擾ATG16L1導致α-toxin引起更多細胞死亡,從ATG16L1低表達的細胞中分離的exsome抗毒素能力顯著降低,提示自噬通過促使表達細菌毒素受體的exsome分泌而保護細胞存活。有趣的是本文作者發現肝細胞來源的exosome,而不是巨噬和樹突狀細胞的,對金葡菌α-toxin發揮抵抗作用,但搜索BioGPS等數據庫顯示巨噬細胞和DC也表達ADAM10,甚至高於肝細胞,所以這背後的機制值得繼續探索。

專家2:蔡教授

蔡教授,專注外泌體理論和應用研究。15年來,發表了包括Immunity在內的數十篇外泌體領域的高水平論文,並有多項相關專利正在臨床轉化。

外泌體是以內體依賴的方式產生的具有脂質雙分子層結構的納米級囊泡。胞膜內陷形成早期內體,早期內體在成熟過程中,相互融合,形成晚期內體,晚期內體通過脂質雙分子層的內出芽,形成腔內囊泡,從而進一步發育成熟為多囊泡體。多囊泡體有兩種去向,一種去向是與溶酶體融合,介導內容物的降解;另一種則是與質膜融合,將腔內囊泡釋放到胞外,形成外泌體。本文從ATG16L1蛋白為切入點,揭示細菌通過自噬體途徑調節外泌體的形成。正常情況下,細菌感染,通過DNA和CpG DNA激活感染細胞的TLR9信號,促進含有ADAM10蛋白的自噬體與多囊泡體融合,隨後多囊泡體/自噬體的聯合體與質膜融合,促進外泌體的生成,從而介導ADAM10蛋白以外泌體依賴的途徑外排。當抑制ATG16L1的水平時,這一途徑受阻,所產生的結果便不難理解。既ADAM10總蛋白和膜蛋白在細胞積累。而ADAM10是α-toxin的受體,結果細胞對α-toxin抵抗能力減弱。自噬途徑參與外泌體的調節已經有不少文獻報道。TLR信號參與外泌體生成調節在該文中也並非首次報道。作者從另外一個獨特的視角解讀了自己的發現。他們認為在細菌感染時,宿主細胞通過增加含有ADAM10蛋白外泌體的釋放,利用該外泌體為誘餌,去中和細菌產生的α-toxin,從而使宿主細胞增強對細菌的抗性。這一視角很大程度上提高了本文的科學意義,因為它揭示了宿主細胞主動逃逸細菌感染的防禦機制,從而為臨床上治療抗生素抵抗細菌感染患者,尤其是耐甲氧金葡菌感染的患者提供了嶄新的治療思路。

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關鍵字: 拆解 誘彈 ATG16L1