在研究腫瘤的思路里，一般都會想著找到一個顯著差異的特徵或者差異表達的基因，然後通過調節這個因素證明其中的通路和機制，找到“潛在的靶點”。
但其實大家也都心知肚明，腫瘤是存在異質性的，哪怕是一個病人的病灶也存在異質性，在細胞層面上則表現為細胞多樣性。
這種細胞多樣性恰恰是很多腫瘤病人尤其是實體腫瘤病人治療失敗、預後不好的關鍵因素。
近日，Cell子刊Cancer Cell online了一篇美國國立衛生研究院Xin Wei Wang課題組題為“Tumor Cell Biodiversity Drives Microenvironmental Reprogramming in Liver Cancer”研究論文，
論文揭示了癌細胞的多樣性驅動微環境的重編程，為我們理解腫瘤多樣化的生態系統及其對患者預後的影響提供了新視角。
以下為官網中Xin Wei Wang的簡介：
下面由小鹿給大家簡單介紹一下這篇論文。
為了研究腫瘤細胞的生物多樣性，該研究用單細胞測序的方法測了19個接受了免疫檢查點治療的肝細胞肝癌（HCC）和肝內膽管癌（iCCA）病人。
其中12個病人組成一個訓練集（5115個細胞），另外7個組成驗證集（4831個細胞）。
PS：分析異質性或多樣性時用單細胞測序在技術上就高了一層，因為組織中往往混合了不同類型的細胞。
結果如圖所示，A為研究的流程，B圖表明這12個病人的腫瘤細胞可以形成不同的cluster，有些獨立，有些相互重疊。
而C圖表明，有些細胞會有較高的表皮marker基因表達，提示這些腫瘤細胞可能有著相同的腫瘤起源。
然後他們轉錄組數據鑑別出了702個惡性細胞和4380個非惡性細胞，並概括了腫瘤細胞的染色體拷貝數變異，發現和之前的報道基本一致。
一些marker基因（epithelial marker genes 和liver marker genes）在惡性細胞和非惡性細胞中有著顯著的差異。
然後研究人員進一步把惡性細胞單獨拿出來分析，發現不同病人的腫瘤細胞各自為戰，成為一簇。
而且有些病人的腫瘤細胞的點佔的面積大，有的佔的面積小，說明不同病人的腫瘤細胞的異質性也存在差異，即瘤內異質性和瘤間異質性（A圖）。
那些非惡性細胞就不一樣了，相同的細胞類型會聚集在一塊形成單獨的一簇（B圖）。
不同的病人，細胞的組成也存在差異，C圖表示了不同病人的惡性細胞和非惡性細胞在數量上和比例上都有差異，而D圖無常的比例圖表明不同病人的基質細胞比例存在非常大差異。
為了進一步研究腫瘤的瘤內異質性，他們確定了每個病人的腫瘤細胞軌跡圖（A圖）。
並根據10個肝癌乾性相關基因的平均表達確定了腫瘤細胞之間的鄰近相似性，及與細胞乾性之間的關係，發現腫瘤細胞的相似性隨腫瘤的不同而有著很大的變化。
所有惡性細胞的相關性分析進一步揭示了腫瘤之間的轉錄組生物多樣性，比如H38病人的腫瘤細胞群相對均一，而C25病人的腫瘤細胞則相對多樣化（B圖）。
PCA的分析也同樣證實了這一點（C圖）。
為了衡量瘤內異質性，研究人員用PCA的方法建立Diversity score，並將其分為每組4個病人的高低兩組。
檢驗發現兩組間的score（E圖）和生存時間（F圖）存在顯著差異，這一現象在驗證集中也得到證實。
同時，研究人員也發現Diversity score能很好的區分HCC病人的生存曲線，卻不能區分iCCA的病人，比較後才發現原來HCC和iCCA的Diversity score存在顯著差異。
將12個病人分為3類，發現Diversity score低的一組，預後最好，Diversity score高的一組預後最差，說明腫瘤內的異質性會影響病人的生存預後。
然後研究人員將非惡性細胞分群和Diversity score結合起來進行分析，發現Div-High 和Div-Low兩組的表達譜有著明顯的差異（A圖）。
每種細胞類型中的分佈也有差異（B圖），表明腫瘤細胞的生物多樣性可能與腫瘤微環境的重編程有關。
為了研究Div-High的腫瘤是不是釋放了什麼細胞因子導致微環境的重編程，他們用了圖C的研究策略發現了VEGFA這個分子。
VEGFA主要在惡性細胞中表達（圖D），在Div-High和Div-Low也有顯著差異表達（圖E），免疫生化的結果也證明了這一現象。
因為VEGFA是HIF1A的直接靶標（沒錯，又是這個HIF1A！），研究人員將一些缺氧相關的基因在Div-High和Div-Low兩組中進行了差異表達分析。
發現VEGFA名列榜首，而且與HIF1A的共表達關係也是top1！
而H圖中結果也進一步證實了Div-High的腫瘤中有更高的HIF1A表達水平和缺氧信號。
同時研究人員也發現VEGFA的替代基因也能區分Div-High和Div-Low的腫瘤，說明在Div-High和Div-Low中確實存在顯著差異的VEGFA信號。
因此，Div-High惡性細胞可能產生VEGFA，這可能影響微環境的重編程從而影響患者的預後。
文章最後，研究人員單獨研究了微環境中的T細胞。
發現Div-High中的T細胞更傾向於聚集在進化樹的樹幹上，而Div-Low中的T細胞更傾向於聚集在樹枝上。
基因富集分析的結果也發現Div-High的這組會富集到EMT這種經典的腫瘤相關通路。
同時研究人員也發現一些和免疫活性相關的重要基因在Div-High組中會顯著的低表達，也就是說Diversity score可能能夠作為一個免疫抑制狀態的marker。
1. HCC和iCCA有著非常顯著的轉錄組多樣性；
2. 腫瘤轉錄組層面的多樣性與病人預後密切相關；
3. 腫瘤來源的VEGF驅動微環境的重編程；
4. 高異質性腫瘤中的T細胞細胞殺傷活性較低。
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