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索氏梭菌（Paeniclostridium sordellii，以前稱為Clostridium sordellii）是一種厭氧孢子生成菌，其毒力菌株可在人和動物中引起致命性感染。在人類中可導致水腫、壞疽、低血壓和全身中毒性休克，死亡率約為70%。婦女因婦科手術、分娩、流產等感染風險最高，宮內感染的死亡率接近100%。索氏梭菌的主要毒力因子是兩種外毒素，致死毒素TcsL（約270kDa）和出血性毒素TcsH（約300kDa），其中以TcsL更為重要。這兩種毒素均屬於大型梭菌毒素（Large Clostridial Toxin，LCT）家族，其它還包括艱難梭菌（C. difficile）毒素TcdA和TcdB，產氣莢膜梭菌（C.perfringens）毒素TpeL，和諾維氏梭菌（C. novyi）毒素Tcn。在所有LCT中，TcsL的致死率最高。數據表明肺血管內皮細胞是TcsL在體內的主要病理靶點。通常細胞受體決定了毒素的細胞和組織特異性，目前，是否存在TcsL的特異性受體尚不清楚。
2020年4月16日，哈佛醫學院波士頓兒童醫院董民教授團隊在Cell Host & Microbe 雜誌上發表了題為 Genome-Wide CRISPR Screen Identifies Semaphorin 6A and 6B as Receptors for Paeniclostridium sordellii Toxin TcsL 的研究長文。
文章通過CRISPR-Cas9介導的全基因組敲除文庫篩選及體外體內功能實驗證實了TcsL通過識別細胞表面的腦信號蛋白（Semaphorin）6A和6B（SEMA6A和6B）來特異性識別併入侵細胞，發揮其病理生理功能。阻斷TcsL-SEMA相互作用為體內中和TcsL和降低索氏梭菌感染的高病死率提供了一種潛在的治療方法。
首先，作者通過應用人肺癌細胞系A549進行了CRISPR-Cas9介導的全基因組敲除文庫篩選。文庫中的每個細胞都會表達某一特定sgRNA並靶向某一特定基因。當加入TcsL進行多輪篩選後，存活下來的具有抗性的細胞通常失活了一些基因，這部分基因對毒素毒殺細胞過程起到重要作用，並可以通過高通量測序進行檢測。其實在最終的測序結果中，SEMA6A和6B拷貝數並不十分突出。作者考慮到有可能是受體冗餘現象在作祟。簡單來說，當毒素可以利用多個功能互補的受體入侵細胞時，單一受體敲除並不足以對細胞產生足夠的抗性，因而無法在最終篩選結果中富集足夠多的拷貝數。於是作者對測序結果進行了二次篩選，將細胞表面定位的蛋白重新排序。其中，SEMA6A是候選受體中分數最高的。這一分析為今後操作同類篩選並解決基因冗餘問題提供了新的思路。
在接下來的細胞生物學研究中，作者發現在多種不同的人類細胞模型（包括上皮細胞系和原代內皮細胞）中，同時敲除或干擾SEMA6A和6B的表達會降低細胞對TcsL的敏感性；而過表達SEMA6A或者6B則會增加其敏感性。加入重組純化的SEMA6A或者6B的胞外結構域（extracellular domain，ECD）可以競爭性抑制TcsL的細胞毒性。而其他SEMA6家族成員以及其他SEMA家族的代表則沒有同樣的性質。因此，作者推論SEMA6A和6B為TcsL的共受體，這也驗證了作者之前對於受體冗餘的猜想。
接下來，作者利用生物膜層光學干涉技術（biolayer interferometry，BLI）來表徵TcsL-SEMA相互作用。作者發現SEMA6A和6B可以與TcsL產生較強的相互作用，而其他SEMA6家族成員以及其他SEMA家族的代表則不能結合TcsL。這一結果與細胞生物學實驗相符合。在所有的LCT中，TcsL與TcdB的相似性最高（70%序列一致性）。TcdB的細胞受體為人捲曲受體（Frizzled，FZD）家族蛋白，二者通過TcdB的捲曲受體結合域（Frizzled binding domain，FDB）相互作用。同時作者發現，TcsL上與TcdB-FBD同源的一段序列（氨基酸殘基1285-1804）介導了其與SEMA的相互作用。有趣的是，在TcsL和TcdB之間交換受體結合域可以切換它們受體結合的特異性。
圖1. TcsL-SEMA相互作用
最後，作者利用小鼠模型驗證了SEMA6A-ECD蛋白可以在體內降低TcsL對小鼠的肺組織損傷和致死率。這些發現進一步證實了SEMA6A和6B是TcsL的受體，且與其病理生理功能密切相關。
哈佛醫學院波士頓兒童醫院田松海博士為本文第一作者。吉林大學第一醫院劉楊博士參與了小鼠實驗。哈佛醫學院波士頓兒童醫院董民教授為通訊作者。值得注意的是，在本文投稿並送審後，在生物預印本服務器（bioRxiv）上上傳了一篇背靠背文章（https://www.biorxiv.org/content/10.1101/871707v1.full ），與本文的主要發現幾乎完全相同。
董民教授實驗室常年致力於肉毒桿菌毒素（Botulinum neurotoxins）及其他細菌外毒素致病機理及應用的研究。近年來利用CRISPR-Cas9介導的全基因組敲除文庫篩選技術連續發表多篇論文，揭示了不同毒素的細胞受體及致病機理。除本文的TcsL外，還包括TcdB【1】、TcdA【2】、志賀毒素（Shiga toxin）【3】以及蓖麻毒素（ricin）【3】等。這些發現極大推動了領域對於傳染病菌致病機理的認知，並對於開發潛在治療手段提供了新思路。
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.chom.2020.03.007
參考文獻
1. Tao L, Zhang J, Meraner P, Tovaglieri A, Wu X, Gerhard R, Zhang X, Stallcup WB, Miao J, He X, Hurdle JG, Breault DT, Brass AL, Dong M. Frizzled proteins are colonic epithelial receptors for C. difficile toxin B. Nature, 538(7625):350 (2016).
2. Tao L*, Tian S*, Zhang J*, Liu Z, Robinson L, Miyashita S-I, Breault DT, Gerhard R, Whelan S, Dong M. Sulfated glycosaminoglycans and low-density lipoprotein receptor contribute to Clostridium difficile toxin A entry into cells. Nature Microbiology, 4(10):1760 (2019).
3. Tian S, Muneeruddin K, Choi MY, Tao L, Bhuiyan RH, Ohmi Y, Furukawa K, Furukawa K, Boland S, Shaffer SA, Adams RM, Dong M. Genome-wide CRISPR screens for Shiga toxins and Ricin reveal Golgi proteins critical for glycosylation. PLoS Biology, 16(11):e2006951 (2018).
