CRISPR/Cas9可以說是發展得彷彿坐了火箭，這項技術首次走入人們眼簾還是在2012年，但是第一項臨床試驗去年就已經在中國進行了。技術走得太快，就必然存在一些尚未被發現的缺陷。
面對基因修飾，hPSC簡直頑強到底，“寧死不從”[8-13]。
為了找出這其中的關鍵，劍橋諾華生物醫學研究院研究者們開發了一種幹細胞系，這種細胞在特定條件下表達Cas9蛋白，只需慢病毒轉染gRNA就能實現插入特定基因序列。
CRISPR/Cas9過後，滿地殘留著細胞碎片，這個CRISPR/Cas9有毒啊……
基因插入效率是很高，可是細胞也很受傷啊
對照組的細胞不涉及DNA鏈的斷裂，就能好好生存好好擴增，而接受了基因插入的細胞真是慘烈極了，只有少部分尚能活蹦亂跳，大部分都沒能熬過改造。
可見單個位點的DNA雙鏈斷裂，就足以對hPSC產生致死的毒性了！
正常的細胞生長曲線和被“毒害”的細胞
為了探究這個過程中的關鍵分子通路，研究者們對錶達變化較大的基因進行了篩選，最終發現最關鍵的人物竟然是我們都很熟悉的老朋友
p53！進一步摸索，下游的通路則是與p21有關。確實，p53本身也在DNA損傷修復過程中起到了很大的作用[14]，對能修復的損傷就修復，修復不了就讓細胞自殺。
雖然還是有細胞頂不住壓力，但是敲除了p53之後明顯皮實多了
除此之外，研究者還發現，在DNA雙鏈被成功切斷之後，Cas9蛋白還會在切斷位點停留6個小時之久 [18]，這很可能耽誤了正常的DNA損傷修復，加劇了DNA雙鏈斷裂帶來的影響。
CRISPR Therapeutics首席執行官Sam Kulkarni表示，該研究結果可信，雖然研究內容實際並不能覆蓋所有的CRISPR使用情景。另一位因利益關係不願透露姓名的科學家則表示十分擔心，很多CRISPR導致的致命缺陷可能“已被錯過”。[17]
但是這並不意味著CRISPR技術走進了死衚衕。
卡洛林斯卡研究所的生化學家Bernhard Schmierer表示，這些都是十分早期的研究，只是“初步成果”，“目前還不清楚這些發現是否可以影響到臨床實際使用的細胞。”此前在實驗室中進行的研究，從未發現CRISPR導致的癌症，也一定程度上說明了問題。
而且研究關注點在於CRISPR/Cas9技術，在此之外，還有Cpf1等諸多頗具希望的Cas酶，這些酶是否會出現同樣的p53困境還未可知。研究者也認為，如果只是剪除致病基因，而不涉及新基因的插入的話，p53是不會被“調動"的.
技術前行總會遇到瓶頸，而每一次挫折都將使讓我們更加強大。
有問題不怕，發現不了才可怕！
不知道不可怕，從哪瞭解都不知道才可怕！哪裡瞭解？《Medical Trend》來一本啃啃！
[1] https://www.nature.com/articles/s41591-018-0049-z
[2] https://www.nature.com/articles/s41591-018-0050-6
[3]Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339,823–826 (2013).
[4]Hsu, P. D. et al. DNA targeting specifcity of RNA-guided Cas9 nucleases.Nat. Biotechnol. 31, 827–832 (2013).
[5]He, X. et al. Knock-in of large reporter genes in human cells via CRISPR/Cas9-induced homology-dependent and independent DNA repair. Nucleic Acids Res. 44, e85 (2016).
[6] Lombardo, A. et al. Gene editing in human stem cells using zinc fnger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nat. Biotechnol.25, 1298–1306 (2007).
[7]Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K. & Doudna, J. A. Enhanced homologydirected human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife 3, e04766 (2014).
[8] Zwaka, T. P. & Tomson, J. A. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 21, 319–321 (2003).
[9] Hockemeyer, D. et al. Efcient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-fnger nucleases. Nat. Biotechnol. 27,851–857 (2009).
[10]Liu, Y. & Rao, M. Gene targeting in human pluripotent stem cells. Methods Mol. Biol. 767, 355–367 (2011).
[11] Hockemeyer, D. & Jaenisch, R. Induced pluripotent stem cells meet genome editing. Cell Stem Cell 18, 573–586 (2016).
[12] Song, H., Chung, S. K. & Xu, Y. Modeling disease in human ESCs using an efcient BAC-based homologous recombination system. Cell Stem Cell 6,80–89 (2010).
[13] Merkle, F. T. et al. Efcient CRISPR-Cas9-mediated generation of knockin human pluripotent stem cells lacking undesired mutations at the targeted locus. Cell Rep. 11, 875–883 (2015).
[14] Lane, D. P. p53, Guardian of the genome. Nature 358, 15–16 (1992).
[15]https://ki.se/en/news/genome-editing-tool-could-increase-cancer-risk
[16]https://www.cnbc.com/2018/06/11/crispr-stocks-tank-after-research-shows-edited-cells-might-cause-cancer.html
[17]https://www.statnews.com/2018/06/11/crispr-hurdle-edited-cells-might-cause-cancer/
[18]Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L. & Corn, J. E. Nat.Biotechnol. 34, 339–344 (2016).
[19]http://home.bt.com/news/science-news/precision-gene-editing-tool-could-increase-cancer-risk-in-patients-11364277357571
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作者 | 代絲雨
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