CRISPR/Cas9可以说是发展得仿佛坐了火箭，这项技术首次走入人们眼帘还是在2012年，但是第一项临床试验去年就已经在中国进行了。技术走得太快，就必然存在一些尚未被发现的缺陷。
面对基因修饰，hPSC简直顽强到底，“宁死不从”[8-13]。
为了找出这其中的关键，剑桥诺华生物医学研究院研究者们开发了一种干细胞系，这种细胞在特定条件下表达Cas9蛋白，只需慢病毒转染gRNA就能实现插入特定基因序列。
CRISPR/Cas9过后，满地残留着细胞碎片，这个CRISPR/Cas9有毒啊……
基因插入效率是很高，可是细胞也很受伤啊
对照组的细胞不涉及DNA链的断裂，就能好好生存好好扩增，而接受了基因插入的细胞真是惨烈极了，只有少部分尚能活蹦乱跳，大部分都没能熬过改造。
可见单个位点的DNA双链断裂，就足以对hPSC产生致死的毒性了！
正常的细胞生长曲线和被“毒害”的细胞
为了探究这个过程中的关键分子通路，研究者们对表达变化较大的基因进行了筛选，最终发现最关键的人物竟然是我们都很熟悉的老朋友
p53！进一步摸索，下游的通路则是与p21有关。确实，p53本身也在DNA损伤修复过程中起到了很大的作用[14]，对能修复的损伤就修复，修复不了就让细胞自杀。
虽然还是有细胞顶不住压力，但是敲除了p53之后明显皮实多了
除此之外，研究者还发现，在DNA双链被成功切断之后，Cas9蛋白还会在切断位点停留6个小时之久 [18]，这很可能耽误了正常的DNA损伤修复，加剧了DNA双链断裂带来的影响。
CRISPR Therapeutics首席执行官Sam Kulkarni表示，该研究结果可信，虽然研究内容实际并不能覆盖所有的CRISPR使用情景。另一位因利益关系不愿透露姓名的科学家则表示十分担心，很多CRISPR导致的致命缺陷可能“已被错过”。[17]
但是这并不意味着CRISPR技术走进了死胡同。
卡洛林斯卡研究所的生化学家Bernhard Schmierer表示，这些都是十分早期的研究，只是“初步成果”，“目前还不清楚这些发现是否可以影响到临床实际使用的细胞。”此前在实验室中进行的研究，从未发现CRISPR导致的癌症，也一定程度上说明了问题。
而且研究关注点在于CRISPR/Cas9技术，在此之外，还有Cpf1等诸多颇具希望的Cas酶，这些酶是否会出现同样的p53困境还未可知。研究者也认为，如果只是剪除致病基因，而不涉及新基因的插入的话，p53是不会被“调动"的.
技术前行总会遇到瓶颈，而每一次挫折都将使让我们更加强大。
有问题不怕，发现不了才可怕！
不知道不可怕，从哪了解都不知道才可怕！哪里了解？《Medical Trend》来一本啃啃！
[1] https://www.nature.com/articles/s41591-018-0049-z
[2] https://www.nature.com/articles/s41591-018-0050-6
[3]Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339,823–826 (2013).
[4]Hsu, P. D. et al. DNA targeting specifcity of RNA-guided Cas9 nucleases.Nat. Biotechnol. 31, 827–832 (2013).
[5]He, X. et al. Knock-in of large reporter genes in human cells via CRISPR/Cas9-induced homology-dependent and independent DNA repair. Nucleic Acids Res. 44, e85 (2016).
[6] Lombardo, A. et al. Gene editing in human stem cells using zinc fnger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nat. Biotechnol.25, 1298–1306 (2007).
[7]Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K. & Doudna, J. A. Enhanced homologydirected human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife 3, e04766 (2014).
[8] Zwaka, T. P. & Tomson, J. A. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 21, 319–321 (2003).
[9] Hockemeyer, D. et al. Efcient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-fnger nucleases. Nat. Biotechnol. 27,851–857 (2009).
[10]Liu, Y. & Rao, M. Gene targeting in human pluripotent stem cells. Methods Mol. Biol. 767, 355–367 (2011).
[11] Hockemeyer, D. & Jaenisch, R. Induced pluripotent stem cells meet genome editing. Cell Stem Cell 18, 573–586 (2016).
[12] Song, H., Chung, S. K. & Xu, Y. Modeling disease in human ESCs using an efcient BAC-based homologous recombination system. Cell Stem Cell 6,80–89 (2010).
[13] Merkle, F. T. et al. Efcient CRISPR-Cas9-mediated generation of knockin human pluripotent stem cells lacking undesired mutations at the targeted locus. Cell Rep. 11, 875–883 (2015).
[14] Lane, D. P. p53, Guardian of the genome. Nature 358, 15–16 (1992).
[15]https://ki.se/en/news/genome-editing-tool-could-increase-cancer-risk
[16]https://www.cnbc.com/2018/06/11/crispr-stocks-tank-after-research-shows-edited-cells-might-cause-cancer.html
[17]https://www.statnews.com/2018/06/11/crispr-hurdle-edited-cells-might-cause-cancer/
[18]Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L. & Corn, J. E. Nat.Biotechnol. 34, 339–344 (2016).
[19]http://home.bt.com/news/science-news/precision-gene-editing-tool-could-increase-cancer-risk-in-patients-11364277357571
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作者 | 代丝雨
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