克隆猴成功的秘诀有哪些呢？
中科院神经科学研究所的研究人员克服了克隆灵长类动物的挑战。他们成功的关键即在于充分利用了最新的表观遗传学成果：
完成核移植之后，研究人员向卵细胞导入了表观遗传修饰的调节因子：KDM4D和TSA，以此来启动胚胎发育的功能基因。因为导入了表观遗传修饰因子，体细胞核中原本被抑制的基因重新被激活，并最终在代孕雌猴中获得了很高比例的受孕率和正常发育率。
具体来说，在用TSA处理后又注入KDM4D mRNA的重构卵中，有44.7%发育成了囊胚。这些囊胚中又有64.7%形成内细胞团（Inner Cell Mass）。相比只使用TSA——囊胚获得率为16.7%——有很大提高。由此看来，组蛋白去甲基化酶KDM4D显著改善了SCNT的猴胚胎的表观遗传重编程，这一点与张毅教授组有关鼠和人的发现是相同的。
那么，组蛋白甲基化修饰究竟作用于供体核的哪些基因？换句话说，哪些基因的失活在阻碍重编程的进程呢？为了找到答案，研究人员用RNA测序技术，发现了可能导致SCNT克隆胚胎发育不良的基因，包括一些发育多能性相关基因如Dppa2，Dppa4和Myc，以及其他抑制基因如Zscan4和Polr3h。这些基因在胚胎发育中发挥了什么功能？如何通过操纵这些基因来促进SCNT胚胎的发育？这些谜底的揭开需要进一步的研究。
“中中”和“华华”的供体细胞核，来自同一只流产的猴胚胎的成纤维细胞，研究人员从中获得了大量遗传背景相同的细胞核。他们也尝试了使用成年猴的体细胞核作为供体，但所得的克隆猴因呼吸异常，在出生后只存活了几个小时。 由此看来，相比胚胎体细胞，成体体细胞的重编程的阻碍更大，但其具体机制还不明确。蒲慕明院士在发布会中提到，如果成体体细胞作为供体的重构胚胎再多一些，也许是会成功的。
中科院神经科学研究所的研究人员指出，他们选用胚胎成纤维细胞作为供体的另一个原因，是便于在体外对其进行基因编辑和筛选，避开CRISPR-Cas9技术的脱靶问题和嵌合体现象，进而大量获得遗传背景相同的克隆动物。
研究负责人孙强介绍说，“我们尝试了多种方法，但只有一种可行。成功得到克隆猴之前，我们经历了多次失败。” 论文第一作者刘真曾花了三年时间练习和优化SCNT技术（图5）。为了快速准确地从卵细胞中去除细胞核，促进供体细胞核和去核卵细胞的融合，他测试了多种方法。
体细胞核移植技术中的显微注射步骤（B,C,D,E,F）；重构细胞融合后正常发育为带有内细胞团的囊胚
这些优化改进操作包括：用偏振光成像系统定位并去除卵细胞的遗传物质；将核供体细胞与仙台病毒包膜（HVJ-E）一起温育；使卵细胞透明带形成激光损伤，以便于将供体细胞核注入卵周间隙（图5D、E、F）。
中科院神经科学研究所所长、该研究的合作者蒲慕明院士指出，SCNT技术的实验步骤非常精致，你操作得越快，卵细胞受到的破坏就越少。刘真博士的手很巧，很能干，但也付出了大量的实践。并不是每个人都能准确迅速地完成去核和细胞融合的操作，核移植技术的优化是我们取得这一成功的关键（图6）。
中国科学家使用体细胞核移植技术制备出克隆猴
目前，“中中”和“华华”还在喝奶（瓶喂）期，它们的生长发育与同龄猴子相比无异。研究人员也会继续关注“中中”和“华华”的身体发育和智力发展。预计未来几个月会有更多的克隆猕猴诞生。研究人员也计划继续改进技术。
在庆祝克隆猴成功之余，有待科学家解决的问题还有很多。比如，如何安全地获取胎猴的体细胞？为何成体细胞核产生的克隆猴存活时间短？不同哺乳动物重构胚胎的重编程能力差异是由哪些因素决定的？不同哺乳动物的多能相关基因的表观修饰有何差异？等等。
除此之外，人们最关心的，可能还是：
克隆猴技术所面对的伦理问题
这项动物研究工作严格遵循了美国国立卫生研究院制定的国际指南。至于在克隆非人类灵长类动物时，哪些做法可取，哪些做法不可取，孙强和蒲慕明鼓励科学界就此展开讨论。
蒲慕明院士强调，我们非常清楚这类准则的重要性，将来，无论在世界何处，如果使用非人灵长类动物进行实验，都需要科学家严格遵循道德伦理标准。
在新闻发布会上，也有多位记者就使用灵长类动物做实验的伦理问题发问。对此，蒲慕明院士表示：
“克隆猴的目的是出于其对人类医学价值的考量。现有的很多动物疾病模型与真实人类疾病表现有不同之处，猴子作为动物模型有其他动物无法比拟的优势。而且，这项克隆猴技术使得短期内（约9个月）就能获得遗传背景完全相同的一代动物，实际上最终能够减少动物的使用量。
几年前基因编辑兴起的时候，人们就其应用做过热烈讨论，出台了严格的管理规则，现在实施得比较好，收到了不错的效果。中国的动物实验也会严格遵守国际标准。希望这项工作能使更多的人认识到克隆猴作为动物模型的优越性和重要性。”
不过，相信人们还是会禁不住发问：
“克隆猴会被人类温柔以待吗？”
“克隆猴已经降临，克隆人还会远吗？”
……
对于这样一个科技改变世界的时代，你是充满期待还是……不寒而栗？ 不过这些都不重要，不妨看看视频里面可爱的小猴子，也许能改变您的看法？
1 刘真, 蔡毅君, 孙强. 非人灵长类基因修饰模型研究进展. 生物工程学报, 2017, 33(10): 1665-1673.
2 Matoba S et al.Embryonic development following somatic cell nuclear transfer impeded by persisting histone methylation.Cell. 2014, 6;159(4):884-95.
3 Chung YG et al.Histone Demethylase Expression Enhances Human Somatic Cell Nuclear Transfer Efficiency and Promotes Derivation of Pluripotent Stem Cells.Cell Stem Cell. 2015, 3;17(6):758-766.
4 Mummery CL, Roelen BA.Stem cells: Cloning human embryos.Nature. 2013,13;498(7453):174-5.
5 Loi P et al., A New, Dynamic Era for Somatic Cell Nuclear Transfer?Trends Biotechnol. 2016, 34(10):791-7.
6 Cell, Liu, Z. et al: "Cloning of macaque monkeys by somatic cell nuclear transfer"
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