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Western Blot以組織或細胞中的蛋白質為研究對象，經過SDS-PAGE分離蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的一抗起免疫反應，再與酶或同位素標記的二抗起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術廣泛應用於定性檢測蛋白水平的表達。
本文總結了Western Blot實驗中常見的問題與解決方案，希望對大家有用，當然有描述不恰當的地方，歡迎批評指正。
一、 Western Blot的操作流程
二、WB操作過程中常見問題和解決方案
（1）樣本問題
問題：蛋白濃度太高或者鹽濃度太高；
解決：稀釋樣本，減少上樣量或者降低鹽濃度
（2）轉膜問題
問題：轉膜強度太強，導致目的位置上方的雜帶太強
解決：降低轉膜強度（時間和電流），使目標蛋白上方的蛋白少轉移到膜上。
問題：轉膜氣泡
解決：A.轉膜過程中儘量去除氣泡，使膜，濾紙和膠緊密結合；
B.抗體孵育的過程中，保持膜的充分浸潤。
（3）膠的問題
問題：泳道部分彎曲；
解決：可能是膠的問題；可能是上樣時多餘的膠孔未用1x loading buffer補齊
（4）二抗選擇問題
問題：二抗選擇問題；
解決：如果這種膜還在，沒有幹過，用1XTBST洗滌5min/3次，然後從封閉開始，重新WB接下去的步驟。
（5）抗體稀釋度問題
問題：雜帶多，背景大；
解決：降低上樣量，增加一抗的稀釋比。
（6）曝光問題
問題：條帶中間顯白，可能一抗或二抗加入過多；上樣過多，導致中間底物消耗過快，結束之後不發光
解決：增加ECL的稀釋度，減少上樣量，增加一抗的稀釋度。
（7）ECL液問題
問題：ECL顯色過程中熒光淬滅過快；
解決：根據ECL液的特性，儘快選擇顯色（有些ECL液需要混勻孵育幾分鐘後才能達到最優的效果）
（8）條帶粘連
問題：條帶粘連；
解決：上樣量太多，減少上樣量；制膠問題，分離膠和濃縮膠之間有間隙，樣品竄孔。
三、其他常見問題及解決方案
（1）顯影后，檢測不到信號
可能原因
解決辦法
一抗和二抗不匹配
1.二抗需和一抗宿主的物種相同（如一抗來自兔，二抗為抗兔抗體）。
沒有足夠的一抗或二抗結合目標蛋白
1.降低一抗的稀釋度（二抗一般確認體系之後不調）；
2.使用效價高的一抗；
3.延長抗體孵育時間，一抗 4℃過夜，二抗室溫 1-2h；
4.在孵育一抗或者二抗的時候，幾張膜疊在一起，導致孵育不充分；
5.一抗和二抗量不足，或者膜飄浮在表面，導致孵育不充分。
抗原量不足
1.檢測樣本中目的蛋白表達較少；
2.每泳道蛋白上樣量少，總蛋白量不低於；
20-30μg，使用蛋白酶抑制劑並設置陽性對照；
3.磷酸化抗體檢測優先使用 BSA 進行封閉；
4.使用相應的刺激，使目的蛋白表達丰度提高。
組織中目的蛋白含量低
1.選擇特異表達目的蛋白的組織；
2.組織新鮮，及時提取，儘快使用；
3.使用相應的蛋白酶抑制劑。
轉膜不充分或電極插反沒轉成功
1.根據目的蛋白的分子量，選擇合適的轉膜條件；
2.轉膜結束後，用麗春紅對膜進行染色，分析轉膜效果（也可對殘留膠進行考染，觀測轉膜效率）；
3.轉膜時電極插反，導致轉膜失敗；
4.選擇相應的轉膜液；
5.膜孔太大，轉膜條件過大，目的蛋白轉過。
洗膜過度
1.降低洗膜強度（洗膜時間，次數和溫度）。
顯色液失活
1.檢測使用的顯色液是不是有效，特別是 ECL顯色中，ECL-B 特別容易失效。
顯色方式的選擇
1.ECL 顯色比 DAB 顯色靈敏度高 5-10 倍；
2.ECL 發光液分普通，靈敏，超敏，在信號上有明顯的差異；
3.延長曝光和顯色時間。
（2）顯影后，膜上背景高
可能原因
解決辦法
未進行非特異性封閉或封閉不充分
1.延長封閉條件（一般室溫 1h）；
2.考慮更換合適的封閉劑（例如使用 5%脫脂奶粉）；
3.封閉的時候幾張膜在一起，導致封閉不充分。
一抗濃度過高
1.調整抗體的稀釋比。
抗體孵育溫度過高
1.改變抗體孵育的方式（由原來的室溫孵育改為 4℃孵育）。
一抗或二抗與封閉劑有交叉反應
1.更換合適的封閉液（有時候脫脂奶粉的效果封閉比較好）；
2.當用脫脂奶粉封閉背景較高時，選擇 BSA 進行封閉(脫脂奶粉含有酪蛋白，該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白，會結合磷酸化特異性抗體而易產生高背景)。
膜的選擇導致的高背景
1.由於 NC 膜和 PVDF 膜與蛋白結合的原理不同，選擇合適的膜。（例如選擇 PVDF 膜可以增加洗膜強度）
（3）顯影后，檢測發現有多帶現象
可能原因
解決辦法
體內表達的蛋白樣本具有多種修飾形式如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等
1.查閱相應的網站（例如：uniprot），查看相應的轉錄本信息；
2.參考其他抗體的網站信息，查詢目的蛋白的分子量，和表達情況。
蛋白樣本降解
1.提取的樣品時間長，發生明顯降解；
2.提取蛋白的時候，加入蛋白酶抑制劑；
3.樣品保存得當，儘量在室溫的時間減少。
一抗濃度過高，高濃度時常出現多條蛋白帶
1.增加一抗的稀釋比例；
2.降低一抗和二抗的孵育時間。
二抗濃度過高，高濃度產生非特異性結合
1.一般二抗體系清楚，不調二抗的稀釋比例，降低二抗的孵育時間；
2.降低抗體濃度，增加二抗對照（不加一抗）；
3.選擇適當的孵育時間，一般為室溫 60 分鐘，時間過長易出現非特異性的條帶。
靶蛋白形成多聚體
1.對於易於形成多聚體的蛋白，在 SDS-PAGE電泳上樣前，煮沸 10 分鐘而不是 5 分鐘，使蛋白解聚。
（4）其他問題及解決辦法
問題描述
可能原因
解決辦法
內參出現兩條帶
樣品和抗體原因
1.減少上樣量；
2.增加抗體的稀釋比例。
條帶很淺，甚至沒有
樣品和抗體原因
1.選擇樣本是否有目的蛋白高丰度表達；
2.增加上樣量；
3.降低抗體的稀釋比例；
4.磷酸化的抗體選擇 BSA 的封閉液；
5.樣本中加入相應的蛋白酶抑制劑；
6.顯色體系問題（ECL-B 液效果降低）。
Western Blot 是一個細心的技術活，實驗操作過程中注意細節，例如實驗室的同學經常說配好的膠中會產生氣泡，這是因為我們配膠用的30%丙烯酰胺和N，N’-亞甲雙丙烯酰胺、AP、TEMED等都是在4°C儲存，臨用前沒有提前取出恢復室溫，因此凝膠過程產生的熱量會使低溫時溶解於儲存液中的氣體析出而導致氣泡。說了這麼多，真心希望對初學者有用。
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