20世紀初開通的京滬鐵路和津浦鐵路在南京被隔斷在長江兩岸無法貫通，過江客貨都要乘船擺渡。1930年，南京國民政府聘請美國橋樑專家約翰·華達爾進行實地勘察，華達爾認為“水深流急，不宜建橋”。1933年10月22日，下關煤炭港至浦口開通了中國首個火車輪渡，1949年前後運力為每日20渡，中華人民共和國成立後將運力提高到1958年的每日100渡。
1956年，武漢長江大橋還在建設之中，中央政府又做出在南京建設長江大橋、貫通京滬鐵路線的決定。武漢大橋的設計施工是在蘇聯專家的幫助下進行的，而南京大橋的設計工作全部由中國完成。毛澤東主席曾詢問大橋工程局局長彭敏，是否還要請蘇聯專家。彭敏回答不需要，讓毛澤東主席很滿意。
1959年2月，大橋工程局開始進駐南岸和北岸工地，6月28日引橋工程開始打樁。11月15日，南京長江大橋工程指揮部成立，大橋工程局局長彭敏任總指揮，梅暘春任總工程師。1960年1月18日，主體工程正橋橋墩開工，大橋建設全面啟動。大橋在建設過程中，克服了技術、自然災害等多方面的困難。
1966年春，正橋橋墩全部出水，然而當時國際形勢緊張，中國在西南開展大規模的“三線建設”加強戰備，佔用了大量物資和資金，大橋工程的物資再度短缺。當時還有人說，既然大橋在戰爭中肯定挨炸，是否還有必要完工。鐵道部到南京調查，與江蘇省委第一書記江渭清等研究後，確定了“簡化、快通、耐用，準備挨炸，炸了再修”的原則。周恩來總理批示，不停工，繼續架設鋼樑使鐵路通車，公路橋和附屬工程從簡，儘量壓縮投資。
1968年9月30日，鐵路橋首先通車，南京市五萬多軍民舉行了隆重的通車典禮，同時大橋的配套工程南京火車站也舉行落成典禮。10月1日，上海鐵路局正式接管鐵路橋並開始運營，凌晨3時，從福州開往北京的46次快車成為鐵路橋上通過的第一列客車。12月29日，公路橋正式通車，南京長江大橋全線貫通。
大橋是華東交通的關鍵工程，上層為路寬15米、全長4588米的四車道公路橋，連通104國道、312國道等跨越長江的公路網；下層為寬14米、全長6772米的雙軌複線鐵路橋，連接津浦鐵路與滬寧鐵路，使中國交通大動脈京滬鐵路得以貫通，是南北交通要津和命脈。南京長江大橋是第一座完全由中國設計建造並基本採用國產材料的特大型橋樑，因而在中國橋樑史上具有重要意義。該橋是南京的標誌性建築。
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