膽汁酸代謝物調節Th17和Treg細胞分化

撰文 | 阿強

膽汁酸為膽固醇來源的天然表面活性劑，由肝細胞通過細胞色素P450氧化膽固醇生成並分泌至十二指腸。哺乳動物腸道內膽汁酸含量豐富，可由腸道細菌轉化成大量具有生物活性的小分子庫進而調節脂質消化、抗菌防禦及葡萄糖代謝【1-2】。圖1顯示的是膽汁酸生物合成、轉運及代謝途徑【2】。大多數膽汁酸可經小腸末端的迴腸重吸收並循環回到肝臟，而部分膽汁酸可經細菌轉化至具有多樣化學結構的次級膽汁酸。在正常人群的腸道，膽汁酸可保護腸道上皮細胞並對病原菌產生抵抗，提示這些膽汁酸具有潛在的調節腸道免疫細胞的功能。

圖1. 膽汁酸生物合成、轉運及代謝途徑。哺乳動物體內最豐富的膽汁酸包括初級膽汁酸 (膽酸CA、鵝脫氧膽酸CDCA)及次級膽汁酸(脫氧膽酸DCA及石膽酸LCA)。本圖來自參考文獻【2】

2019年11月28日，來自美國哈佛大學醫學院免疫學系的Jun Huh課題組，聯合紐約大學醫學院Dan Littman課題組及斯坦福大學Michael Fischbach課題組（共同一作為Saiyu Hang和Donggi Paik）在Nature雜誌在線發表了題為Bile acid metabolites control TH17 and Treg cell differentiation的研究論文，通過對膽汁酸代謝物化合物的篩選，發現了石膽酸LCA兩種不同的代謝產物(3-oxoLCA和isoalloLCA)可在小鼠上調節T細胞功能，提示膽汁酸代謝物可通過直接調控TH17和Treg細胞平衡，從而調控宿主免疫。

首先，研究人員為尋找調節T細胞功能的膽汁酸，對近30個初級和次級膽汁酸在內的化合物進行篩選。研究人員使用野生型C57BL/6小鼠(B6Jax小鼠)分離出初始CD4+ T細胞，並在TH17細胞和Treg細胞分化狀態下與膽汁酸共培養 (圖2) ，發現兩個石膽酸衍生物能顯著影響TH17細胞和Treg細胞分化：(1) 3-oxoLCA可抑制TH17細胞分化，表現在顯著降低的IL-17a；(2) isoalloLCA可促進Treg細胞分化，表現在FOXP3表達的增加。進一步研究發現，3-oxoLCA作用於TH17細胞和isoalloLCA作用於Treg細胞的調節效應具有細胞類型特異性，且兩個衍生物均不影響T細胞分化至TH1或TH2型T輔助細胞。

圖2. 膽汁酸代謝物篩選方法

隨後的機制研究實驗分兩部分。第一部分欲揭示3-oxoLCA如何抑制TH17細胞分化。此前Jun Huh博士在Dan Littman組博後訓練期間，曾發表Nature論文，報道了地高辛及其衍生物可作為TH17細胞抑制劑，這是因為地高辛具有固醇樣結構【3】，通過結合並抑制RORγt來發揮效應。隨後，Dan Littman組陸續發現多種具有類似膽固醇結構的化合物可成為RORγt調節劑【4】。因此，研究人員進一步想知道的是，3-oxoLCA在體外系統是否可以與RORγt蛋白相互作用。通過熱遷移實驗，研究人員證實了3-oxoLCA 可結合至RORγt配體結合域，且平衡解離常數遠低於另外兩個3-oxoLCA結構類似物。隨後的熒光素酶報告實驗進一步確認了3-oxoLCA可抑制RORγt轉錄活性。因此，這一部分實驗證明，3-oxoLCA可能通過與RORγt相互作用，抑制其轉錄活性從而抑制TH17細胞分化。

第二部分實驗欲證明isoalloLCA如何促進Treg細胞分化。由於LCA具有三個同分異構體，iaoLCA、alloLAC及isoalloLCA，其中isoalloLCA具有最低的logD值，與已報道的鵝脫氧膽酸及熊脫氧膽酸近似，提示isoalloLCA與其他同分異構體相比，親脂性更低。小鼠分離初始CD4+ T細胞培養實驗證明了isoalloLCA可提高FOXP3表達，且進一步被FOXP3-GFP報告小鼠分離出的T細胞實驗佐證。而FOXP3轉錄可通過CNS1、CNS2和CNS3三個非編碼增強子調節，因此，研究人員通過流式細胞分析進一步證實，

細胞代謝和表觀修飾息息相關，且已知的是，Treg細胞主要依賴於氧化磷酸化以進行能量生成。因為，下一步需要回答的問題是，isoalloLCA是否影響氧化磷酸化？研究發現，isoalloLCA處理後可顯著增加氧消耗量，提示isoalloLCA可增強線粒體活性。為證明這一假設，研究人員分別比較了isoalloLCA對線粒體ROS水平和胞漿ROS水平的影響，並使用線粒體靶向抗氧化劑進行反向驗證。進一步通過Foxp3啟動子區域H3K27ac的分析，研究人員證實了isoalloLCA促進Treg細胞分化的兩個機制，(1) 提高線粒體ROS產量；(2) 增加Foxp3啟動子區域的H3K27乙酰化 (圖3)。

圖3. 膽汁酸代謝物isoalloLCA促進Treg細胞分化的示意圖

最後，研究人員想要回答的問題是，3-oxoLCA和isoalloLCA在小鼠在體模型上是否也可以影響TH17細胞和Treg細胞的分化呢？此前，Littman組在Cell發文報道，小腸內的節絲狀菌SFB能促進TH17細胞分化【5】。當時，研究人員比較了Taconic公司及Jackson公司兩種來源的小鼠，這是因為Taconic來源的C57BL/6J小鼠 (B6 Tac小鼠) 腸道存在SFB，因此具有大量TH17細胞，而B6 Jax小鼠因缺乏SFB而具有較少的腸道TH17細胞 (見圖4，來自Littman組該Cell文章) 。

圖4. Jackson及Taconic來源C57BL/6小鼠迴腸末端腸道菌的比較分析 (來自參考文獻【5】)

基於此前期研究，本文中，研究人員對B6 Jax小鼠灌胃給與含SFB的糞便顆粒，隨後給與正常飼料或含3-OxoLCA飼料達一週，使得體內3-oxoLCA含量達到足以抑制TH17細胞分化的濃度 (圖5) 。研究人員發現，給與3-oxoLCA能顯著抑制迴腸 TH17細胞比率，而天然含有SFB細菌的B6 Tac小鼠在餵食3-oxoLCA後也表現出TH17細胞比率的顯著下降 (圖5 a&b)

圖5. 在體實驗證明，3-OxoLCA可抑制TH17細胞發育，而isoalloLCA可提高Treg細胞

另外，研究人員還對腸道內的膽汁酸代謝物進行了檢測，發現3-oxoLCA 和 isoalloLCA 都存在於人體內。更重要的是，在無菌小鼠體內沒有發現這兩種代謝物，只有普通有菌小鼠體內存在，提示這些代謝物是腸道共生菌的代謝產物。那麼究竟哪些細節可以代謝膽汁酸，並且影響體內T細胞功能呢？筆者瞭解到，與Jun Huh課題組相鄰的哈佛醫學院另外一個課題組——Kasper課題組，近期將有另外一篇Nature文章來詳細解答這個問題。

據悉，在本文的審稿過程中，同行評議認為本文提出了一個新穎而及時的概念，並概述了兩種非冗餘機制，合成膽汁酸衍生物可通過這些機制調節T細胞的發育和功能。該研究在TH17 和Treg細胞分化的背景下表徵了次級膽汁酸的功能，這使其成為將腸道微生物衍生產品與腸道功能聯繫起來的有效機制研究，明確揭示了膽汁酸可發揮非常重要的調節功能，並參與塑造機體免疫系統。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41586-019-1785-z

參考文獻

1. Shapiro et al., (2018) J Exp Med. Bile acids in glucose metabolism in health and disease. 215(2):383-396.

2. Jia et al. (2018) Nat Rev Gastroenterol Hepatol. Bile acid-microbiota crosstalk in gastrointestinal inflammation and carcinogenesis. 15(2):111-6128.

3. Huh et al., (2011) Nature. Digoxin and its derivatives suppress TH17 cell differentiation by antagonizing RORγt activity. 472(7344):486-90

4. Santori et al., (2015) Cell Metabolism. Identification of natural RORγ ligands that regulate the development of lymphoid cells. 21(2):286-298

5. Ivanov et al., (2009) Cell. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. 139(3):485-98

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關鍵字: 代謝物 哈佛大學 膽汁酸