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高分文獻都在用的Kymograph analysis，運動粒子分析必備技能！
2019年9月Cell發表了一篇重磅研究【1】，該研究鑑定出定位於少突膠質細胞的高爾基體“前哨”細胞器的的特異性標記物TPPP（Tubulin polymerization promoting protein），揭示了TPPP在髓鞘形成等方面的重要功能以及微管組織方式的詳細分子機制。
作者通過Kymograph analysis發現少突膠質細胞具有均勻的微管極性，即85%–92%的微管遠離細胞胞體生長：
Kymograph analysis是用來分析粒子運動方向的方法，例如2017年Kononenko NL通過Kymograph analysis觀測囊泡的運動情況【2】。
今天半夏就給大家分享使用ImageJ進行Kymograph analysis！
1 軟件準備及Macro安裝
ImageJ下載鏈接：https://imagej.nih.gov/ij/ 。Fiji下載鏈接：http://fiji.sc/Fiji 。KymographClear宏下載鏈接：https://drive.google.com/file/d/0B1Ea2O-bSM0naXdHdlBSVUczUGs/view 。
KymographClear宏的安裝，將下載好的KymographClear.txt放置於ImageJ macro toolset文件夾，重啟ImageJ軟件即可：
2 Kymograph analysis分析步驟
1. 打開ImageJ軟件的KymographClear宏，其菜單如下：
2. 通過菜單的第一個按鈕可以打開圖像序列，有兩種圖像序列打開方式：打開圖像序列並計算平均強度（快捷鍵F1）或打開序列並計算最大強度圖像（快捷鍵F2）：
以第二種方式打開圖片序列：
然後選擇要打開的圖像範圍(如果要打開整個序列，只需按OK)：
顯示的圖像序列與最大強度顯示如下：
3. 定義kymograph分析軌跡
通過Segmented line tool（分段線工具，快捷鍵F3）追蹤需要進行分析的軌跡，可以通過Image –> Adjust –> Brightness/contrast調節對比度亮度以實現軌跡的最佳可視化。
通過使用鼠標重複單擊來創建與粒子軌跡重疊的分段線，完成後雙擊或右鍵單擊(請注意，線條的起點將是kymograph分析的原點)：
單擊宏工具集上的樣條線按鈕或鍵入快捷鍵F4來樣條化選擇的軌跡：
4. Kymograph analysis
點擊Kymograph按鈕或輸入F5快捷鍵：
Kymograph宏中可選擇生成kymograph線條的寬度，推薦寬度為5：
Kymograph analysis得到五個新的圖形，Kymograph可以顯示粒子運動或靜止情況：
前向運動(左)、後向運動(中心)和靜態粒子(右)的圖形如下：
RGB彩色圖像紅色表示向前運動，綠色表示反向運動，藍色表示靜態粒子：
Kymograph位置是沿著水平的(定義軌跡的第一個點在左側)，並且時間是沿著垂直的(時間零對應於頂部)：
5. 估計背景
為了估計絕對粒子強度，需要估計接近所選軌跡的圖像背景。使用多邊形選擇工具（Polygon selections）在所選軌跡周圍新建多邊形選框：
點擊Background button：
名為background.txt的文件現在保存在“kymograph”文件夾中。此文件包含為序列中的每個圖像選擇的區域的平均像素值。此文件可用於校正背景：
6. 數據分析
數據分析軟件KymographDirect下載鏈接：www.nat.vu.nl/~erwinp/downloads.html 。
打開KymographDirect軟件，其界面如下：
打開Kymograph文件夾下ImageJ分析得到的Kymograph_1.txt文件：
點擊Forward可以分析向前運動的粒子的速度及其他指標：
可分析的指標有：
例如粒子運動速度隨時間的變化如下：
點擊Backward可以分析向後運動的粒子：
右擊導出分析數據即可：
今天給大家分享使用ImageJ進行Kymograph analysis就到此為止，希望對大家有所幫助！
參考文獻:
1. Fu MM, McAlear TS, Nguyen H, et al. The Golgi Outpost Protein TPPP Nucleates Microtubules and Is Critical for Myelination. Cell. 2019;179(1):132-146.e14.
2. Kononenko NL, Claßen GA, Kuijpers M, et al. Retrograde transport of TrkB-containing autophagosomes via the adaptor AP-2 mediates neuronal complexity and prevents neurodegeneration. Nat Commun. 2017.
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