前段时间笔者给大家分享了一篇稿件——《历时三年零一个月，论文终于被接收了，这大概是最悲催的投稿经历了吧》。在文章中，笔者分享的那篇论文从投稿到接收耗费了3年多时间，可谓非常长。有投稿慢当然也有投稿快的论文，今天笔者就给大家分享一篇最新Nature论文，从submit到online仅用2个多月，审稿速度非常快（Nature论文的平均投稿周期是1年），我们一起来看看吧！
2020年2月6日，牛津大学威廉·邓恩病理学院IvanAhel教授团队在Nature杂志上发表题为《HPF1 completes the PARP active site for DNA damage-induced ADP-ribosylation》的研究性论文，该文解析了HPF1与PARP形成复合物的晶体结构，并找到了复合物的催化活性位点，为PARP抑制剂的临床研究提供了重要依据。
研究背景：PARP (聚腺苷二磷酸核糖聚合酶)是一种DNA修复酶，通过与DNA损伤位点相结催化多聚ADP核糖链在蛋白底物上的合成。并且募集其它DNA修复蛋白到损伤位点共同修复DNA损伤。如今PARP抑制剂是一个非常热门的研究领域，它是第一种成功利用合成致死概念获得批准在临床使用的抗癌药物。但是PARP发挥催化作用的结构和机理目前并不清楚。
研究结果：首先作者在检测PARP1-HPF1相互作用时发现一个问题：免疫共沉淀实验和pull down实验中存在检测到相互作用，并且酶活实验中加入少量HPF1可以调节PARP1的酶活，但分子筛实验并没有观察到PARP1和HPF1的结合。如果向HPF1和PARP1中加入了DNA或底物NAD +类似物则促进了分子筛实验中复合物的形成，其中DNA结合可以使PARP1蛋白中HD（螺旋亚结构域）局部展开，释放一个NAD +结合的位点。这说明HD抑制了HPF1与PARP1 /2的结合，而DNA和NAD +类似物的稳定作用与其调节HD的能力有关。作者通过体内实验进一步验证了这一结果。
根据这一结果作者将HPF1和缺乏HD的PARP在加入NAD + 类似物 EB-47的条件下共结晶从而得到分辨率为3.0Å的结构。从结果可以看出复合物形成了一个结合的活化位点，通过HPF1的Asp283与PARP2的His381（PARP1中的His826）之间相互作用达到稳定的效果，其中HPF1的Glu284位于酶的核心。并且核磁共振实验表明在PARP1与HPF1相互作用的方式与得到的PARP2晶体结构大致相同。
根据上面的晶体结构接下来作者使用放射性ADP-核糖基化试验检测HPF1核心位点突变对PARP活性的影响，其中Asp283，Asp286和Arg239突变为丙氨酸极大地降低了催化活性，而HPF1的Glu284突变后观察到PARP丝氨酸-ADP-核糖基化的能力完全丧失。这说明D283A，D286A和R239A突变导致HPF1-PARP1 / 2相互作用的不稳定，而Glu284位点在丝氨酸底物募集或催化本身中起到关键作用。体内过表达实验进一步验证了在晶体中观察到的HPF1和PARP结合界面，同时也表明Glu284参与底物募集或催化。
为了进一步研究HPF1 Glu284位点的潜在功能作者将PARP1与ARTCs（霍乱毒素样ADP-核糖基转移酶）进行比较发现这类酶需要两个催化作用的负电荷残基，其中PARP2的Glu545和霍乱毒素亚基A1的Glu112发挥相似的作用，但PARPs不具有霍乱毒素Glu110对应的氨基酸，该位置被HPF1-PARP复合物中的HPF1的Glu284占据，导致形成复合活性位点。并且作者鉴定出HPF1和PARP1 / 2界面的一个肽结合面，在体内这个结合面适合与丝氨酸-ADP-核糖基化底物中高度丰富的Lys-Ser（KS）模块结合。
最后作者对相互作用界面上PARP表面残基进行了体外和体内分析，结果显示与HPF1的相互作用取决于两个保守区域：第一个是对聚（ADP-核糖）链延长和丝氨酸-ADP-核糖基化都很重要的His环结构，第二个是位于C末端的Leu-Trp序列。
研究小结: PARP1和PARP2都是不完整的酶，需要辅助因子HPF1。HPF1-PARP相互作用产生了一种新的复合酶，其中PARP1 /2和HPF1都有参与底物结合和催化的残基。使用复合HPF1-PARP1 / 2酶可在体外重建天然DNA损伤依赖性ADP-核糖基化。因此该文研究了DNA损伤后ADP-核糖基化合成和逆转的初步结构和机理作用，为PARP抑制剂的临床研究提供了重要的参考依据。
閱讀更多 輯思編譯 的文章
