2020年2月29日，中山大學

摘要

HCoV-19感染重症患者可出現急性呼吸窘迫綜合徵（ARDS）、高凝狀態、高血壓、肺外多器官功能障礙和較高的死亡率。已發表的治療指南通常包括抗病毒、抗菌藥物和生命支持療法，但仍迫切需要安全有效的抗凝藥物改善整體預後。我們以HCoV-19蛋白酶Mpro（又名3CLP或nsp5）為靶點，對FDA（食品藥品監督管理局）批准的藥物數據庫進行了篩選，發現雙嘧達莫（Dipyridamole, DIP）結合Mpro。體外實驗發現DIP抑制HCoV-19複製的EC50可低至100nM。DIP激活抗病毒的I型干擾素通路並在病毒性肺炎模型中顯著改善肺損傷。

在使用DIP進行輔助治療的12例HCoV-19感染患者的臨床試驗中，我們發現DIP輔助治療可顯著升高血小板和淋巴細胞計數，降低D-二聚體水平。DIP治療2周後，6例重症中的3例（50%）以及所有4例輕症（100%）出院。1例在接受DIP治療前就具有極高水平D-二聚體和淋巴細胞嚴重減少的危重症患者死亡。其他的患者目前都已進入臨床康復期。總之，DIP的輔助治療可以明顯改善HCoV-19感染的患者的臨床症狀，機制可能與抑制病毒在體內的複製，抑制血液高凝狀態，提高機體免疫力有關。對此，亟需大規模開展臨床試驗以驗證DIP對HCoV-19的治療效果。

新型冠狀病毒HCoV-19（又稱SARS-CoV-2）於2019年12月在中國湖北省武漢市爆發。截至2月24日，中國共有77,056例COVID-19確診病例，包括2,446例死亡病例。日本、韓國、意大利、新加坡、伊朗、泰國和美國等28個國家也報道了超過2500例感染病例。到目前為止，對COVID-19的治療還缺乏特效藥。因此，探索已批准應用於臨床的藥物作為治療COVID-19的潛在藥物，利用研究人員積累的研究經驗以及臨床醫生的用藥經驗，在疾病爆發之際輔助用藥挽救患者生命，可以節省大量的研發時間和臨床資源。

HCoV-19同SARS-CoV和MERS-CoV一樣屬於β-冠狀病毒屬，它們是一種具有包膜的、全長約30,000個核苷酸的正鏈RNA病毒。HCoV-19也是通過S-蛋白與人細胞表面ACE2受體的介導作用進行入侵。ACE2在人體多器官中廣泛表達，包括肺、心、腎和腸。然而，在SARS-CoV感染的實驗模型中，Spike蛋白的參與降低了ACE2的表達，激活了腎素-血管緊張素系統（RAS）。RAS的激活促進了血小板粘附和聚集，增加肺栓塞、高血壓和纖維化的風險。同時，它還通過增加局部血管緊張素II濃度來加速心臟和腎臟的損傷。除了經典的RAS途徑外，腸內ACE2缺乏與營養不良和結腸炎症有關。

與感染SARS-CoV的患者表現出的臨床症狀相似，在重症監護室（ICU）收治的COVID-19患者，也表現出凝血時間延長、D-二聚體陽性、嚴重淋巴細胞減少、ARDS、高血壓和急性心臟損傷等臨床症狀。ACE2參與水解血管緊張素II，有報道稱在HCoV-19感染的患者體內，血管緊張素II水平升高且與病毒負荷正相關[20]。這些數據提示臨床治療中，應用抑制通過ACE2進入體內的病毒的藥物時應注意避免激活RAS。此外，還應預防性進行抗凝治療，以降低嚴重COVID-19患者肺栓塞和多器官損傷的風險。

病毒進入宿主細胞後，冠狀病毒信使RNA首先被翻譯成多種蛋白質，隨後由兩種病毒蛋白酶：3C樣蛋白酶（3CLP，又名nsp5或Mpro）和木瓜蛋白酶樣蛋白酶（PLP，又名nsp3）進行切割，以產生病毒複製所必需的非結構蛋白。因此，抑制這些蛋白酶活性或許可以抑制病毒的複製，為治療HCoV-19提供思路。

雙嘧達莫（DIP）是一種抗血小板藥物，作為磷酸二酯酶（PDE）抑制劑，可提高細胞內cAMP/cGMP水平。除了眾所周知的抗血小板功能外，DIP可能有利於COVID-19患者的治療。首先，在已發表的研究中，包括在中國開展的臨床實驗，都證實了DIP具有廣譜抗病毒活性，尤其是針對正鏈RNA病毒。其次，它可抑制炎症發展並促進黏膜癒合。第三，作為泛PDE抑制劑，DIP可防止肺、心、肝、腎等器官的急性損傷和進行性纖維化。

在本研究中，我們提供了3個層面的證據來支持DIP對HcoV-19病毒感染的治療作用。首先我們發現DIP具有抗Mpro活性，因此可直接抑制HCoV-19的複製。其次在VSV誘導的小鼠肺炎模型中，DIP增強機體的抗病毒免疫力，降低死亡率。在開展的一個小樣本量DIP輔助治療COVID-19患者的臨床試驗中，我們發現DIP輔助治療可提高循環中淋巴細胞和血小板計數，降低D-二聚體水平，臨床療效顯著。

試驗情況

患者和研究變量

截至2020年2月8日，武漢大學中南醫院共有124例COVID-19確診病例（表S1）。所有患者均符合國家衛生委員會辦公廳制定的《新型冠狀病毒感染肺炎診斷與治療方案（第6版試行）》的診斷標準。對這些患者的醫療記錄進行回顧性分析，以凝血指標和血小板為參數，包括凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、血漿纖維蛋白原（FIB）、D-二聚體、血小板（PLT）計數和平均血小板體積（MPV）。根據C-反應蛋白（CRP）、降鈣素原（PCT）和白細胞介素6（IL-6）水平評估全身炎症反應。

研究設計

通過回顧性分析驗證DIP輔助治療的臨床有效性。患者於2020年1月23日至2020年2月22日在中國湖北省大悟縣人民醫院隔離病房就診，每天監測患者的病情，包括體格檢查、毒性檢查、胸部CT掃描和生化指標。在治療過程中對凝血變量、血液指標、肝腎功能指標和胸部CT進行常規實驗室檢查。臨床症狀和實驗室數據由兩名專職調查人員記錄，以確保數據的準確性。如果患者符合下列任何一項標準，則診斷為重症：（1）呼吸頻率≥30次/min；（2）血氧飽和度SpO2≤93%；（3）PaO2/FiO2≤300mm Hg。如果符合下列任何一項標準，則診斷為危重症：（1）呼吸衰竭，需要機械通氣；（2）休克；（3）合併多器官功能衰竭，則需轉入重症監護室（ICU）。大悟縣人民醫院倫理委員會批准了此次臨床試驗。所有參與的患者或者家屬簽署了知情同意書。

治療方案雙嘧達莫150毫克/天，分三次口服，持續用藥7天。每日監測患者狀態。所有患者均接受抗病毒（利巴韋林，0.5g，Q12h），皮質激素（甲潑尼龍琥珀酸鈉，40mg，qd），氧療，必要時給予營養支持。

結果

DIP抑制HCoV-19病毒的複製

我們篩選了獲得FDA批准的藥物庫，發現DIP可以結合HCoV-19的蛋白酶Mpro。疏水作用力和氫鍵（H-鍵）是DIP與Mpro結合的主要驅動力。根據自由能擾動計算，DIP和Mpro之間的結合自由能DGpred為-6.34k cal/mol。採用SPR法測定了DIP與Mpro在體外的結合親和力。實驗證實DIP與Mpro的結合親和力為34μM（KD，eq）。

為了檢驗DIP是否對HCoV-19複製有直接的抑制作用，我們利用細胞系檢測了DIP刺激後的病毒滴度。氯喹作為陽性對照。我們發現0.1μM的DIP可以顯著抑制50%的HCoV-19病毒的複製。在人體給與DIP，藥物的血液濃度可達3uM。因此，治療劑量的DIP或許能有效抑制HCoV-19在體內的複製。然而與氯喹相比，DIP對HCoV-19病毒複製的劑量依賴性抑制作用並不顯著，提示DIP可能利用不同機制對病毒起抑制作用。

DIP激活I型干擾素通路，保護小鼠免受病毒性肺炎的侵襲

已發表的臨床研究都提示DIP的光譜抗病毒作用。我們的實驗結果驗證這一結論。在單鏈RNA病毒（仙台病毒SeV和水皰型口膜炎病毒VSV）刺激的A549細胞中， DIP（5μM）處理IFNB、IFIT1 mRNA水平升高。poly（I:C）刺激可模擬廣譜RNA病毒感染，DIP給藥劑量依賴性地促進IFNB、ISG15和IFIT1 mRNA的表達。在DIP的作用下A549細胞產生的IFN-β顯著增加。在SeV刺激感染的293T細胞中，DIP可以顯著升高TBK1和IRF3磷酸化水平，提示DIP促進I型干擾素通路的激活。

為了驗證DIP在體內的抗病毒作用，我們建立了VSV病毒誘導的肺炎模型。DIP給藥組VSV感染小鼠的存活率明顯升高，病毒感染導致的肺組織結構的破壞和肺泡炎症減輕。這些結果提示治療劑量的DIP可激發有效的廣譜抗單鏈RNA病毒免疫反應，抑制病毒感染所致的組織損傷。

DIP輔助治療顯著改善COVID-19患者的凝血功能

為了評估COVID-19患者凝血狀況，我們回顧性分析了124名COVID-19患者的隊列（補充表格1），發現其中25例（20.2%）患者血小板計數下降，77例（62.1%）患者凝血酶原時間（PT）延長，27例（21.8%）患者纖維蛋白原（FIB）水平升高，以及 26例（21.0%）患者D-二聚體水平升高。這些數據表明COVID-19患者中凝血功能異常是常見的血液表現。

共有22名患者納入此次臨床試驗，包括10名對照受試者和12名接受DIP輔助治療的患者。兩組患者基礎臨床症狀相似（表1）。DIP組和對照組的患者，平均年齡分別為53歲和58歲。所有患者均表現為咳嗽，大多數患者感到呼吸急促，60.0%患者伴有噁心和嘔吐症狀，胸部CT掃描顯示患者均為雙側肺炎。DIP組中有4例和對照組種有5例患者有合併症（糖尿病、心力衰竭和腦血管病）。所有患者均接受抗病毒、糖皮質激素和氧療，沒有采取抗真菌治療，其他治療包括機械通氣（DIP組16.7%，對照組10.0%）、抗生素（33.3%，30.0%）和靜脈注射免疫球蛋白（16.7%，20.0%）。

經DIP輔助治療兩週後，6例重症中的3例（50%）以及全4例輕症（100%）患者出院。1例危重症患者入院時就有極高的D-二聚體水平和極低的淋巴細胞數，在加入DIP輔助治療治療後也沒能挽救生命。其他的幾例患者都正在恢復中。與DIP組相比，在對照組的輕重度患者的治癒出院率均要低於DIP組（表2）。

加入DIP進行輔助治療之前，DIP組患者的基礎體溫高於對照組，氧合狀況也低於對照組，但經過一天的治療兩者的溫度和氧合情況都穩定下來。我們觀察到，與對照組相比，DIP組淋巴細胞和血小板計數均呈增加趨勢。淋巴細胞減少和血小板減少常伴隨/導致重症和危重症的發生，DIP有效的幫助病毒感染的機體恢復免疫力，阻止病情向重症以及危重症發展。

值得注意的是， DIP組的4名患者和對照組的2名患者在入院時就具有較高的D-二聚體水平（表1）。通過監測患者的D-二聚體水平的動態變化，我們發現對照組的D-二聚體水平呈持續上升狀態，而DIP組D-二聚體水平穩步降低並穩定在較低水平。

我們對2名危重症患者使用了DIP輔助治療，其中一名在入院時血氧飽和度非常低，並伴有缺氧和多器官功能衰竭的70歲男性患者死亡。 在加入DIP治療前，這名患者的D-二聚體水平極高（16.2μg/mL）和淋巴細胞數（0.37X109/L）也已將至很低。 由於他的血氧飽和度持續很低，在接受DIP治療的第5天去世。另外一名危重症患者在DIP加入治療前也有很低的氧飽和度和較高的D-二聚體水平（8.83μg/mL），D-二聚體水平曾一度高達15.72μg/mL。在接受DIP輔助治療後，D-二聚體水平逐步下降到3.69μg/mL，血氧飽和度也在提高，患者由危重症進入康復階段。這些臨床發現也提示了高D-二聚體水平和低淋巴細胞計數與預後不良有關，並表明在疾病進展到危重症之前就應開始進行DIP治療。

所有患者在治療前都進行了胸部CT掃描，結果顯示為典型的多片狀磨玻璃樣影。在DIP治療的患者中，肺部浸潤有明顯的吸收。下圖展示了1例重症患者在DIP治療後的一系列的肺部CT掃描。

圖.治療前後胸部CT圖像的軸向視圖（左圖）和冠狀視圖（右圖）

（A）初次胸部CT掃描，DIP治療前10天。（B）胸部CT掃描，DIP治療前5天。（C）胸部CT掃描，DIP治療前2天。（D）胸部CT掃描，DIP治療2天后。（E） 胸片CT掃描，DIP治療7天后。

討論

HCoV-19給人類的健康造成巨大的威脅，目前還沒有任何藥物被有效應用於抗病毒治療。相比SARS-CoV-感染，我們提出假設：HCoV-19的Spike蛋白可能激活肺中的腎素-血管緊張素系統（RAS）。該假說得到了已發表的COVID-19患者的臨床特徵和生化指標的支持，包括ARDS、高血壓、急性心臟、腎損傷和D-二聚體陽性結果。 在尋找有效的抗凝血劑時，我們專注於DIP，因為它具有廣譜的抗病毒、抗炎和抗纖維化作用。我們證實DIP在體外和在VSV誘導的病毒性肺炎模型中對單鏈RNA病毒具有較強的抗病毒能力。最重要的是DIP對HCov-19病毒複製的EC50低至0.1μM，這意味著在人體中這個劑量的DIP就可以在感染的人體中發揮治療作用。的確，在臨床治療中，治療14天后，12個患者中有7名已經出院，4名症狀減輕，進入康復階段。

我們發現，如果DIP輔助治療在早期應用於COVID-19重症患者，能有效的預防血液高凝狀態。DIP治療降低了D-二聚體水平，增加了外周循環中血小板數和白細胞數，從而促進臨床治癒和症狀緩解。D-二聚體水平是一個重要的預後因素，密切反映肺栓塞、血管血栓形成和腎功能不全，決定了ICU患者是否可以從重症感染中恢復。DIP的抗病毒、抗炎及抗高凝作用，可降低HCoV-19感染患者形成微血管血栓的風險。DIP還可以改善血管循環，恢復心臟和腎臟等重要器官的主要功能。

總之，我們建議對早期有D-二聚體水平升高跡象的COVID-19患者進行抗凝治療。DIP作為抗血小板藥物，臨床應用安全。此外，作為泛PDE抑制劑，DIP激活廣譜抗病毒免疫，以及在抗炎和抗纖維化方面也起了重要作用。此外，DIP實用、價格低廉，節約研發時間和醫療成本。在疫情迅速擴散到其他發展中國家的情況下，應當繼續探索研究DIP對COVID-19患者的治療作用。

原文鏈接：

https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.02.27.20027557v1

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