就在奧斯曼帝國兵團與西班牙帝國軍隊會戰於維也納的同年（1529年），教皇與查理五世簽署《巴塞羅那和約》，西班牙正式成為天主教的保護者，查理五世的頭上又飛來一頂王冠，成為意大利國王（倫巴第）。
同年7月26日，查理五世制定約定書。約定書中授予航海家皮薩羅秘魯總督兼總司令、先遣官、警察總監等官銜，授予阿爾馬格羅為通貝斯要塞指揮官，任命盧克為通貝斯主教。
兩年後，1531年1月，皮薩羅率領遠征船隊駛向神秘的印加帝國（今秘魯）。
1532年11月16日，印加王阿塔瓦爾帕率領5000名解除武裝的侍衛，赴約進入西班牙營地的核心區域。皮薩羅發動早已埋伏就位的兵士（不到200人），向印加王及其侍衛發起攻擊。毫不設防且手無寸鐵的印加人很快敗下陣來，侍衛們屍橫遍地。接著皮薩羅又擺開筵席宴請塔瓦爾帕，聲稱這是由於阿塔瓦爾帕不尊重《聖經》和天主教受到的懲罰。
印加王阿塔瓦爾帕提出要用黃金為自己贖回自由。雙方約定，要用金器原件堆滿長22英尺（約6.6米），寬17英尺（約5米）的房屋，金器高度要達到9英尺（約2.7米），在另一個較小的房屋中堆滿銀器。
阿塔瓦爾帕立即向所轄區域下令，將黃金送至卡哈馬卡。金銀送到後，皮薩羅不守諾言，於1533年8月29日絞死了阿塔瓦爾帕。此後，西班牙人又陸續征服了庫斯科、厄瓜多爾、智利等地，將秘魯納入殖民版圖。
皮薩羅以不到200人的兵力征服了擁有數萬士兵，600萬人口的印加帝國，創造了以少勝多的奇蹟。
賈雷德·戴蒙德在《槍炮、病菌與鋼鐵》一書中如此記述：1532年西班牙文盲冒險家弗朗西斯科·皮薩羅率領一支不足兩百人的小部隊，俘虜了擁有600萬人口的印加帝國皇帝阿塔瓦爾帕，最終征服了這個帝國……1532年西班牙強盜皮薩羅帶著鋼鐵武器、鋼鐵盔甲、馬匹、槍炮打上門來的時候，印加帝國皇帝根本對外界一無所知。而在印加皇帝阿塔瓦爾帕死後，皮薩羅先後又進行了四次類似的戰役，參加戰役的西班牙騎兵分別是80人、30人、110人和40人，而每次都以擊潰數以千計甚至萬計的印第安人而告終。
新世界、新人類、新武器，在原始的、未開化的大陸上所向披靡，印第安人在鋼鐵和槍炮面前驚慌失措、束手無策、一敗塗地，中國武俠小說中幻想的絕世高手在百萬軍中如入無人之境的理想狀態，在人類文明的進程中成為現實。
此外，根據賈雷德·戴蒙德《槍炮、病菌與鋼鐵》的記載，鋼鐵武器、槍炮在新大陸上殺戮的人口數量，遠遠比不上這些歐洲人帶來的病菌所消滅的人口數量。
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