有觀點，有態度
這是醫業觀察公眾號的第655-1期文章
前言
化學發光技術已經成為當前免疫診斷市場中最重要的檢測技術。自上世紀70年代誕生以來，儘管隨著檢測設備全自動化水平以及檢測元件精密度、試劑生產保存工藝的發展，化學發光技術的檢測靈敏度有了顯著的提升，然而究其本質而言，無論是酶促發光、直接發光或是電化學發光，化學發光技術在檢測原理上在過去的近50年裡並沒有得到任何改變。可以認為在自動化水平已經達到相當高程度的今天，化學發光技術在現有抗體親和力水平的前提下，已經接近了其檢測能力的極限。
免疫診斷市場在新型標誌物或新型診斷市場上的開拓，可能需要一種從檢測原理層面進行變革的新型免疫診斷技術——單分子免疫檢測。
本文將分為以下幾個部分探討下一代免疫診斷技術——單分子免疫檢測對現有免疫診斷市場的影響以及在體外診斷市場普及應用的可行性。
（1） 化學發光發展現狀
（2） 單分子檢測技術——生物檢測技術的極限標尺
（3） 從化學發光到單分子免疫檢測有多遠
（4） 數字PCR技術的發展給單分子免疫檢測的啟示
（5） 單分子免疫檢測技術發展現狀
（6） 單分子免疫檢測平臺技術分析
（7） 單分子檢測技術是分子檢測與免疫檢測平臺統一化的可行橋樑
（8） 超低成本單分子免疫檢測技術實現的可能性
1. 化學發光技術發展現狀
當今全球範圍內，免疫診斷市場呈現以大型全自動化學發光為主流，多種檢測技術原理、檢測平臺形式多樣化發展的局面。
國內高端免疫診斷市場中，大型全自動化學發光設備基本處於羅氏、雅培、西門子等國際巨頭企業壟斷狀態。儘管邁瑞、新產業等國內龍頭企業近幾年得到迅速發展，但是短期內依然難以改變目前市場份額分配的局勢。
而在POCT細分領域，則有以梅里埃VIDAS、三菱PATHFAST、星童Pylon等為代表的小型全自動單人份POCT試劑條，以美艾利爾、廣州萬孚、南京基蛋為代表的免疫層析試紙，以及雅培iSTAT、華邁興微極光系列、理邦的磁敏免疫產品為代表的微流控POCT產品。化學發光技術憑藉其絕對領先的靈敏度、準確性與精密度，無疑是當前免疫診斷技術中最可靠的檢測方法，它貫穿了從全自動大型設備，到小型全自動POCT設備甚至到微流控POCT的全線免疫診斷產品。
然而，當我們對免疫診斷技術發展歷史進行梳理時候，就會發現化學發光並不是一個新技術。化學發光技術從上世紀70年代中期誕生，到上世紀末以及本世紀初由於羅氏、雅培、西門子等企業通過收購或自主研發推出各大早期化學發光平臺而受到廣泛關注，再到近十年隨著自動化技術的迅速發展，替代了酶聯免疫成為免疫診斷市場最核心的技術，已經經歷了超過40年的時間。
而在這40年裡，無論是酶促化學發光、直接化學發光或是電化學發光，化學發光的檢測技術卻並沒有任何檢測原理層面上的改變，現有的化學發光檢測在靈敏度、準確度的提升幾乎是完全依賴於自動化設備精密度的提升以及發光分子衍生物結構上的改造。
在過去化學發光技術快速發展的近二十年裡，我們習慣了依賴於自動化技術快速發展給免疫診斷市場帶來的精確度與可靠性的提升，卻也習慣了化學發光方法在檢測技術原理上給我們帶來試劑或設備層面的各種枷鎖，形成了定式思維，難以在檢測原理層面實現革新。
2. 單分子檢測技術——生物檢測技術的極限標尺
1967年法國數學家B.B.Mandelbrot在其分形理論中提出了“英國的海岸線有多長”的問題。該理論認為，英國海岸線的長度取決於測量尺子的精確程度。隨著尺子逐漸變小，精確程度逐漸提高，測量所得的海岸線長度將無限增大。與“英國海岸線有多長”的問題相似，我們對生命科學領域的認知範圍也是隨著各種生物檢測技術靈敏度和精確程度的提升而逐漸提升的。
不同的是，在生物分析檢測領域，尺子的最小尺寸似乎是有極限的——單分子水平。包括核酸、蛋白質或是多糖在內的絕大部分生物分析系統，當檢測對象超越了分子水平到達原子水平，檢測都將失去其本來的意義。單分子水平的生物標誌物的研究，為前沿科學領域、醫療診斷領域都提供了難以估量的學術價值與市場機會。
3. 從化學發光到單分子免疫檢測有多遠
圖1 吖啶酯發光過程中的光子方向隨機性
現有的化學發光技術是一種自上而下的檢測邏輯，它通過測量溶液整體光學信號強度換算分子濃度。以吖啶酯化學發光為例，化學發光設備通常是以光電倍增管（PMT）直接檢測溶液整體釋放的光子數，通過積分或發光強度的形式來實現定量檢測。現有的化學發光體係為了提高吖啶酯化學發光檢測體系的靈敏度，除了抗體親和性因素的影響，更為簡單直接的方法就是提高反應體系的整體體積，從而在一定樣品濃度下提高檢測液中結合的吖啶酯分子的總數，來提高被PMT檢測到的光子總數。然而這種檢測形式並不適合於單分子水平的檢測。
要實現單分子免疫檢測必須要實現兩個前提：
（1）單分子信號檢測
（2）單分子信號溯源。
前者是單分子檢測的基礎條件，而後者則是通過單分子計數實現定量檢測的必須條件。
現有的化學發光技術不可能實現單分子免疫檢測，其檢測靈敏度下限的瓶頸來源於分子層面的不確定性。吖啶酯分子在遇到發光激發底物時，會在極短的時間內釋放數個光子，其後結構迅速遭到破壞失去發光能力。由於吖啶酯分子在釋放光子時，光子方向是不可控的，而作為發光檢測設備的核心部件光電倍增管卻是有方向性的（圖1）。這就使得單個吖啶酯釋放的少數幾個光子不能確保被PMT檢測到（不滿足第一點前提條件），同時PMT上捕獲的光子信號也不可能對溶液中單個吖啶酯分子進行溯源（不滿足第二點前提條件）。
當樣品中的抗原分子濃度低到一定程度時，PMT能夠捕獲到光子數量的不確定性將呈指數級提高，導致檢測信號完全被埋沒於背景噪音中，失去定量檢測能力。同樣的問題也存在於電化學發光和酶促化學發光體系中。
因此，在設備自動化技術已經發展到相當高水平的今天，現有的化學發光技術檢測靈敏度已經接近於其理論上的檢測極限水平。
對於現有的免疫檢測體系而言，若需要以更高靈敏度的檢測方法去探尋新的生物標誌物，或是開發新型免疫診斷市場方向，勢必需要在檢測原理層面上進行技術本質的革新。
4. 數字PCR技術的發展給單分子免疫檢測的啟示
圖2 數字PCR工作原理
（PNASAugust 3, 1999 96 (16) 9236-9241; DOI: pnas.96.16.9236）
在過去的近二十年裡，數字PCR技術快速發展可以認為是分子診斷領域最令人振奮的技術進步。數字PCR技術（DigitalPCR）最早由Vogelstein於1999年提出，通過在96/384孔板中極限稀釋DNA模板進行驗證（圖2）。
2003年Dressmam等發明了BEAMing技術，將磁珠、模板、引物等分散到小液滴當中，進行單分子級別的擴增，再利用磁珠對單分子擴增產品進行結合回收分析。
2006年Fluidigm推出了第一臺基於微陣列芯片的商品化數字PCR系統。同年QuantaLife推出液滴式數字PCR技術，並於2011年被Bio-Rad公司以1.62億美元收購，成為後來眾所周知的QX-100系統，正式掀起了數字PCR在資本市場中的熱潮。
2013年Bio-Rad推出升級機型QX-200系統。同年，LifeTechnologies推出了基於微陣列液滴芯片的QuantStudio3D系統，成為QX-200系統主要市場競爭對手。此後，受益於資本市場對數字PCR下一代分子診斷技術地位的認可和推動，國內外湧現了一大批各式數字化PCR技術平臺。
2016年，法國Stilla公司推出了NaicaCrystal平臺，首次推出了三色檢測通道的數字PCR系統。2017年，伯樂完成對競爭對手RainDanceTechnologies的收購，基本完成在液滴式數字PCR細分技術領域的壟斷。
數字化PCR技術的發展不僅推動了現有的分子診斷體系的進步，更為將來分子診斷市場在精準醫學檢測領域，例如基因組拷貝數突變、低丰度DNA模板檢測、二代測序輔助建庫、腫瘤治療伴隨檢監測、稀有致病菌檢測等，提供了必要的技術支持。
數字PCR是當前市場上最具有代表性的單分子檢測技術，它是一種典型的信號放大依賴型的單分子檢測技術，其本質是單分子獨立的信號放大、識別與提取。數字PCR通過將樣品分散到數萬至數十萬個獨立反應單元（液滴或陣列），在每個反應單元中對模板分子進行獨立擴增。擴增後通過測量反應單元熒光信號強度判斷該單元是否含有模板分子，再根據含有模板分子的反應單元所佔比例來換算樣品中模板分子的濃度。
數字PCR的核心理論依據是泊松分佈（Poissondistribution）。泊松分佈是一種統計與概率學裡常見到的離散概率分佈，它描述了單位時間內隨機事件發生次數的概率。對於數字PCR檢測體系則是描述了在一定模板濃度的前提下（λ表示平均每個微單元平均出現的模板個數），在每個固定體積的微反應器（液滴或微陣列單元）中出現模板個數的概率。根據泊松分佈公式，當目標濃度稀釋到極限，λ遠小於1趨近於0時，趨近於0，P（1）趨近於λ，故可通過絕對計數來實現絕對定量。
目前，市場上比較具有代表性的幾個數字PCR技術平臺及其主要技術特點如下表所示：
表1 幾個具有代表性的數字PCR技術平臺特點彙總
數字PCR技術對現有傳統分子診斷技術的衝擊，以及技術層面上單分子檢測的策略方法，讓一些人注意到了將單分子檢測技術應用到體外診斷領域中，佔據最大市場份額的免疫診斷的潛力。儘管近幾年國內數字PCR技術的開發與推廣依然處於如火如荼的快速發展階段，國外更具有先進性戰略眼觀的企業與資本市場早已將啟動了單分子檢測技術在免疫診斷市場的產業化轉化。
2010年，參考數字PCR檢測原理，DavidWalt與David Duffy團隊開發了“DigitalELISA”技術（Single-moleculeenzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolarconcentrations, Nature Biotechnology, volume28, pages595–599 (2010)）。該技術延續了數字PCR單分子檢測邏輯，它以標記後的半乳糖苷酶催化底物產生熒光信號代替數字PCR過程中PCR進行信號擴增的過程，將標記有β半乳糖苷酶的單分子蛋白分散到高通量的微反應器中進行獨立反應，通過對每個微反應器信號的檢測和統計來實現單分子級別檢測。
“DigitalELISA”技術的出現打破了業內對免疫檢測技術檢測靈敏度下限的認知，讓業內意識到單分子免疫檢測技術在醫療診斷市場產業化的可行性。其後，DavidWalt憑藉“Digital ELISA”技術於美國成立Quanterix公司，推出單分子酶聯免疫檢測技術平臺SiMoA。SiMoA一經面世便吸引了眾多國內外業內人員和資本市場的關注，並在其後的幾年內獲得多倫高額的融資。
2015年，Merck公司收購Singulex公司SMC技術在生命科學研究領域的使用權（金額條件未披露），再次將單分子免疫檢測技術推到資本市場的大舞臺。而隨著今年Merck公司主推的穩定性更好的第二代單分子蛋白檢測平臺SMCxPRO系統的大力推進，勢必將引起一陣單分子免疫檢測技術發展的熱潮。
數字PCR技術的快速發展在技術層面上給了單分子免疫檢測技術很好的啟示和推動作用，它在過去幾年裡發展的歷程也讓我們意識到單分子檢測作為下一代檢測技術在體外診斷市場中勢不可擋的發展趨勢。
可以預測，如果說數字化PCR正處於體外診斷資本市場的風口之上，那麼下一個進入體外診斷技術領域風口的有可能是單分子免疫檢測技術。
蘇州宇測生物科技有限公司創始人，致力於單分子免疫檢測技術研究與產業化。
閱讀更多 IVD行業觀察 的文章
