作者：胡景華，廖春華，(汀江武軍，黃新然西農業大學蜜蜂研究所．南呂，王子龍，顏偉玉4330045）
摘要：蜂王質量的好壞決定了蜂群的群勢和生產性能培育優質的蜂王有利於蜂群的飼養管理及提高經濟效益在育工過程巾，育王框所處位置對王臺接受率以及蜂王質量均有所影響、本研究基於免移蟲育王技術，以中華蜜蜂為研究塒象，探究育王框在不同類型子睥之間的位置(封蓋子脾之間、幼蟲睥之間以及混合脾之間)對王臺接受率、蜂工個體形態指標及蜂王卵巢卵黃原蛋白基因表達的影響研究結果表明，育工框置於幼蟲脾之間蜂王幼蟲接受率和蜂王卵黃原蛋白表達量顯著高於封蓋子睥，但塒蜂工個體指標無影響。
關鍵詞：中華蜜蜂；免移蟲育工；育王框位置；蜂正質量
中華蜜蜂Apis ceratla cerana(簡稱巾蜂)是我國特有的蜂種，對我國養蜂業、農業以及生態平衡均有著至關重要的作，【{=j(餘林生，2007；楊冠煌，2009)。蜂王作為蜂群中唯一具有完整生殖能 力的個體，其質量的好壞對蜂群的影響尤為重要。優質的蜂王產卵力強可以使蜂群維持較強的群勢，所產的後代也會表現出較強的生活力及抗病能力(匡邦鬱，2003)。在中蜂養殖過程中南於蜂王衰 老會導致產卵力等一系列機能下降，因此需要每年更換蜂王，以保證蜂群維持較強的群勢，提高蜂產品的產量(劉仰文，1966)。因此，人工培育優質蜂王對中蜂的飼養管理十分重要。
到目前為止，人工育王已有大量的研究，並取得了一定的研究成果，其中包括單式移蟲以及複式移蟲(Doolittle，1888；陳世壁，1989)。但由於在移蟲或移卵過程中稍有不慎便會對卵或幼蟲造成傷害而影響蜂王質量，為了減少對幼蟲的傷害，江西農業大學蜜蜂研究所團隊研製出了免移蟲育王生產器，並已在意大利蜜蜂Apis melliferⅡ始ustica(簡稱意蜂)應用，取得了良好的效果(劉光楠等，201 1；張飛等，2013；Pan et a1．，2013)。與人工移蟲育王相比，免移蟲育王簡單快捷且對幼蟲不會造成機械損傷。在此基礎上，根據中蜂的生物學特性研製了中華蜜蜂的免移蟲育王生產器。鄒垂彬等(2016a)對中蜂的免移蟲育王和人工移蟲育王進行了比較，發現兩種方法培育的蜂王在初生重、胸重和卵巢管數量方面均無差異，但免移蟲育王培育的蜂王腹部卵黃蛋白原基因(Vitellogenin，增)表達量更高。
排除季節與環境等因素，王臺在蜂群中所處位置不同也會對蜂王的質量有所影響(AI—Fattahet a1．，201 1)j基於中華蜜蜂特殊的保溫和散熱機理以及邊脾充足的礦：蜜貯粉等特點，張建國等(2006)研究發現邊二脾易於控制最佳繁殖溫度，更適合蜂王的生長髮育和適齡工蜂的泌漿喂飼及看護，是培育蜂王的最佳位置。王瑞生等(2013)在春秋分蜂熱期間觀察了自然王臺出現的位置，並統計卵蟲脾、封蓋子脾以及蜜粉脾上出現王臺的概率，發現王臺出現在封蓋子脾上的概率顯著高於其他兩組，且蜜粉睥出現的概率僅有8．57％。：在人工育王時為了讓王臺內的幼蟲得到更充分地哺育，通常將育王框置於蜂箱中間位置的子脾之間。但不同的子脾類型(封蓋子、未封蓋幼蟲或卵)對蜂王的質量是否有影響，目前尚無相關報道。因此，本研究採用免移蟲育王方法進行育王，將育王框分別置於兩張封蓋子脾之間、兩張幼蟲脾(未封蓋幼蟲)之間以及兩張混合脾(巢脾上同時有封蓋子和未封蓋幼蟲，比例約為1：1)之問，探究育王框在不同類型的子脾問對出房蜂王質量的影響，為優質蜂王的培育奠定基礎。
1、材料與方法
1．1、試驗材料
1．1．1、試驗蜂群
試驗所需中華蜜蜂飼養在江西農業大學蜜蜂研究所，所有蜂群採用郎氏標準蜂箱飼養；選取蜂王年齡、蜂群群勢(5足框)和蜂群遺傳性狀基本一致的5群蜂作為試驗蜂群；取1群母本群專職產卵，3群哺育群用於育王，1群備用。
1．1．2、主要儀器設備
中蜂免移蟲育王器，育王框，王籠，手術用眼科剪刀，鍍烙遊標卡尺(十分度)，立體解剖顯微鏡，電子天平(MINQIAO，JN3103N)，恆溫恆溼培養箱(BINDER)，實時定量PCR儀(AppliedBiosystems，7500)，離心機(Anke，TGL一16B)，PCR儀(Eppendorf，Mastercycler)，小型臺式冷凍離心機(Eppendorf，Centrifuge 5424R)。
1．1．3、試驗試劑
0．9％生理鹽水，DEPC水，75％乙醇，Trizol試劑．氯仿及異丙醇，引物、滅菌水、ROX和SYBR GREEN II(Takara試劑公司提供)；其中DEPC水、Trizol試劑、氯仿及異丙醇均置於棕色試劑瓶中遮光保存。
1．2、試驗方法
1．2．1、蜂王的培育
1．2．1．1 、免移蟲育王器的準備
免移蟲育王器為江西農業大學蜜蜂研究所研製的中華蜜蜂仿生免移蟲育王生產器(鄒垂彬等，2016b)，包括塑料巢礎、託蟲器、王臺、育王框等(圖1)。
1．2．1．2 、1日齡幼蟲的獲取
將蜂王控於塑料巢脾上產卵6 h後放出，3 d後直接將託蟲器取出並安裝於無底王臺中，將育王框放入哺育蜂群中。
1．2．1．3、哺育群準備
育王時應提前8 h移走哺育群的蜂王，並防止蜂群改造急造王臺和工蜂產卵。隨時調整各哺育群確保蜂群有兩張封蓋子脾(或幼蟲脾或混合脾)(各目的巢脾分別位於邊二脾和邊二三脾)，同時保持群勢基本一致，重複試驗3次(移蟲後將育王框分別放於兩目的巢脾之問)。
1．2．1．4、王臺接受率
移蟲前一天將準備好的王臺放人蜂群中清理，然後將帶有1日齡幼蟲的託蟲器與塑料王臺組裝好固定於育王框上，分別置於蜂群的兩張封蓋子脾(或幼蟲脾或混合脾)之間培育蜂王，2 d後檢查記錄王臺接受情況(王臺加高且周圍有許多哺育蜂表示接受)，計算王臺接受率。
1．2．2、蜂王個體指標測定
初生重：蜂王出房後立刻用電子天平稱重，記錄數據；
胸重：用小手術剪取出蜂王胸部，去除足、翅，用電子天平稱重記錄數據；
測量胸寬：用遊標卡尺測量上述蜂王胸部寬度。
1．2．3、卵巢管計數
參考許少玉等(1984)的蜂王卵巢管解剖和簡便記數法進行蜂王卵巢的解剖，取卵巢中段平行橫切3、4段，選取一段置於乾淨的載玻片上面進行染色，在解剖鏡下用昆蟲針輕輕地將卵巢小管逐條剝離並計數，即可得到每個卵巢的卵巢小管數，記錄數據。
1．2．4、蜂王卵巢卵黃原蛋白基因(Vg)測定
初生蜂王活體解剖取出蜂王卵巢進行RNA提取和cDNA合成，提取RNA和cDNA合成方法參考秦秋紅(2013)。Louren￡o(2008)研究指出JB—actin在蜜蜂中表達十分穩定，本研究以口一actin基因作為內參基因，卵黃原蛋白基因(瞻)引物引用廖春華等(2016)的引物，由上海生工生物有限公司合成(表1)。熒光定量PCR反應體系(10 IxL)：cDNA l txL，SYBR GREEN II 5¨L，上游和下游引物各0．4 IxL，超純滅菌水3．0 IxL，ROX校正液0．2 IxL；各成分混勻加入0．2 mL熒光定量專用8連PCR管(BBI Life sciences公司提供)。熒光定量PCR反應條件：95c|c預變性30 S；95℃，10 S，58．9℃，l min 40個PCR循環。擴增反應結束後從55℃勻速加熱(每6 S升高l℃)至95cc，建立熔解曲線。每個生物學樣本設置5個技術重複，計算各個目的基因的相對錶達水平。
1．2．5、數據統計與分析
王臺接受率和蜂王個體外部指標試驗數據利用StatView軟件進行方差分析；蜂王卵巢瞻基因相對錶達水平用Livak和Schmittgen(2001)建立的2““。法計算後利用StatView軟件進行方差分析與t檢驗，當P<0．05時認為差異顯著。
2、結果與分析
2．1、 育王框位置對王臺接受率的影響
將育王框置於封蓋子脾之間、幼蟲脾之間、混合脾之間的3個試驗組幼蟲接受率分別為 63．6l％、75．69％以及68．75％，其中育王框置於幼蟲脾之間時幼蟲接受率顯著高於封蓋子脾組(P<0．05)，而幼蟲脾組與混合脾組以及封蓋子脾組與混合脾組幼蟲接受率並無顯著差異(表2)。2．2 育王框位置對蜂王個體指標的影響封蓋子脾之間、幼蟲脾之間和混合脾之間3個試驗組在蜂王初生重、胸重、胸寬和卵巢管數等指標均差異不顯著(P>0．05)。不同類型子脾間培育的蜂王在外部指標上並無顯著差異(表3)。
2．3 、育王框位置對蜂王卵巢壇表達量的影響
以混合脾作為對照組，3個試驗組蜂王卵巢vg相對錶達量如圖2所示，其中幼蟲脾蜂王卵巢卵增表達量顯著高於封蓋子牌組(P<0．05)，而幼蟲脾組和混合脾組以及封蓋子脾組與混合脾組幼蟲接受率並無顯著差異 。
3、結論與討論
蜂王的發育受很多因素的影響，移蟲育王時幼蟲日齡的選擇尤為重要，日齡大小對蜂王的初 生重、卵巢管數量、交尾的雄蜂數量和貯精囊內的精子數量等都有直接的影響(Dedej et a1．，1998；Tarpy et a1．，2011)。人工育王時隨著移取幼蟲日齡的增加培育出的蜂王初生重、卵巢管數、儲精囊大小及儲精囊中精子數等各項指標均呈下降趨勢，即幼蟲日齡越小培育出的蜂王質量越優(Wovke，197l；樊瑩等，2013；龐倩等，2017a)。不同日齡幼蟲培育的蜂王在基因表達和蛋白質組方面也存在顯著差異(Pang et al，，2017；龐倩等，2017b)。本研究採用免移蟲育王技術進行人工育王，待卵孵化成幼蟲(即1日齡幼蟲)時置於王臺條上，轉移至哺育群中，這樣既保證了幼蟲為1日齡，又不會損傷幼蟲。
人工育王時王臺在育王框中的位置和王臺的數量均對蜂王的質量產生影響，育王框中部和下部的王臺培育的蜂王質量較好，育王時王臺數量過多會使出房蜂王的質量下降(A1一Fattah et a1．，201 1)。育王框置於幼蟲脾之間時，王臺的接受率顯著偏高(P<0．05)，這可能是由於幼蟲脾上大量的幼蟲需要大量的哺育蜂，使得鄰近的王臺也得到了更多哺育的機會，從而提高了王臺接受率 (Huang，1991)。蜂王的初生重與蜂王質量正相關，並隨季節呈現明顯的變化趨勢，與外界溫度、蜜粉源和蜂群群勢等存在著密切的相關性(謝代癸，1983；畢建璐和李志勇，2003)。本研究中育王框置於封蓋子脾、幼蟲脾和混合脾之間培育的蜂王初生重、胸重、胸寬和卵巢管數等指標差異不顯著(P>0．05)。
Vg是一種多效性基因，為蜂王卵巢的發育提供營養和功能性物質。Vg基因的表達水平對蜂王的免疫力、壽命、卵巢發育以及生殖能力均有影響(Engels，1974；Amdam et a1．，2005；張衛星等，2014；李志勇，2016)。Koywiwattrakul等(2009)研究發現無王群中工蜂卵巢發育後瞻的表達量是卵巢未發育工蜂的的4倍，是有王群中卵巢未發育工蜂的12倍。因此Vg的表達量可以用來衡量雌蜂的卵巢活化程度。幼蟲脾之間出房的蜂王卵巢Vg表達量顯著高於封蓋子脾之間出房的蜂王卵巢Vg表達量，這說明幼蟲脾之間的位置培育的蜂王卵巢激活程度相對更高，但具體機理尚不清楚。不同位置培育的蜂王在交尾後的產卵力、壽命和免疫力方面是否表現更為優越還有待於進一步研究。
綜上所述，育王框置於不同類型子睥之間培育的蜂王在個體指標方面沒有明顯差異，但是王臺接受率和瞻表達量均是幼蟲脾之間最高。因此，在人工育王過程中應儘可能將育王框置於未封蓋的幼蟲脾之間，以提高王臺接受率和蜂王卵巢活化程度
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