近年來，生物犯罪的不斷髮生，已經嚴重威脅到人類生存安全和政治社會穩定，諸如日本“鈴木醫生事件”和美國“炭疽信件事件”等，甚至有人猜測，“甲型H1N1流感病毒”也是實驗室的“傑作”。生物犯罪所造成的破壞是巨大的，會引起民眾的恐慌，且其具有造價低廉、技術難度不大、研製隱蔽性強等特點，因此備受恐怖犯罪分子的青睞。法醫微生物學是在已有學科基礎上發展起來的，包括傳統的法庭科學、流行病學、微生物學和分子生物學等，其大致可分為醫學微生物學、環境微生物學和食品微生物學共3個分支[1]，其中本文討論的生物犯罪就屬於環境微生物學所研究的內容。在應對生物犯罪的研究和應用中，法醫微生物學的任務就是識別生物犯罪，以一種科學的、強有力的方式進行生物證據的去汙、收集、保存和鑑定，並運用信息化數據手段，以達到確定生物恐怖因子的來源和鎖定犯罪行為人的目的。
1生物犯罪的識別
蓄意生物犯罪可分類為公開的或秘密的[2]。它們之間的區別在於，公開的生物犯罪可以立即被識別，而秘密的生物犯罪可能在一段時間內都不能被發現。
1.1可疑乾粉樣本的初篩
乾粉樣本的初篩分類是處理可疑生物犯罪案件的第一步。Włodarski等用波長280、340和460nm的三個脈衝激發待測樣本產生熒光，結果發現基於熒光衰減的不同可以用來識別乾燥生物樣本的類別[3]。Crighton等採用定量PCR（qPCR）技術開發了Bt毒素基因cry1的檢測方法，並在2009個生物恐怖事件騙局中評價該方法的有效性，結果證實，結合溼擦拭取樣，cry1 PCR是一種快速、可靠的用於檢測和定量的轉基因汙染的診斷工具 [4]。
1.2生物犯罪的監測
法醫微生物學在生物犯罪中的作用分兩個方面：對可疑的非正常死亡個體或群體的監測和對已知生物犯罪的反應。屍檢是準確識別傳染病和中毒導致死亡的有機體或特定病原體的最佳方法。傳染病相關死亡的監測可以增加識別生物犯罪的機會。從2000年開始，美國新墨西哥州醫學研究者辦公室開發和測試了一個用於監測生物恐怖主義和傳染病死亡率的法醫監測模型（“Med-X”），通過一系列臨床症狀來確定哪些病例應該接受屍檢，並根據解剖所見的病理綜合徵決定是否向公共衛生當局進行報告，如下：（1）流感樣症狀（發熱或寒戰或肌痛）；（2）發熱和呼吸系統症狀（咳嗽或呼吸急促或胸痛或咯血）；（3）腦病（伴有或不伴有其他神經系統症狀的急性精神狀態改變）或新發性癲癇發作；（4）下行麻痺，多發性神經病；（4）新的致命的皮疹；（5）新發黃疸；（6）沒有黑便的急性血性腹瀉；（7）50歲以下的個體出現意外死亡（過去的病史和現場調查提供的診斷不足以確定死因），且沒有其他任何上述症狀。出現上述一組臨床症狀的死亡病例應接受屍檢。
2證據的去汙淨化
對可能被生物恐怖因子汙染的屍體、殘留物或疑似樣本（如密封的信件、液體和工具），應當在不破壞法醫證據的前提下，採用及時的、必要的去汙淨化措施。
2.1消毒劑清洗
如果屍體表面存在可見的重度汙染，則必須對其進行清潔，然後將其送入屍檢設施，並在現場採集適當的樣本。賈德勝等以大腸桿菌和枯草桿菌為指示菌，採用有效氯濃度為 500 mg/L 洗消劑進行噴淋，結果發現，延長洗消液作用時間和洗消後再沐浴液洗浴能確保洗消效果[6]。當然，該方法缺點也是顯而易見，洗消會造成法醫檢材的破壞。
2.2γ射線滅活
γ射線對細胞有殺傷力，醫療上用來治療腫瘤。Ortatatli等採用γ射線進行了滅活炭疽桿菌的實驗研究，發現使用11.58 kGy劑量等γ射線可滅活紙張樣本上的炭疽桿菌，而使用17.21 kGy劑量等γ射線可滅活紡織物和液體樣本上的炭疽桿菌。故而，對一些特別敏感和有價值的材料表面進行炭疽桿菌滅活處理時，尤其是在這些材料不能進行溼性處理淨化的情況下，建議使用20 kGy輻射劑量的γ射線滅活[7]。此外，這種方法不會破壞現有的生物證據，不影響法醫血清學和分子檢測。
2.3甲醛氣體滅活
甲醛對一系列微生物是有毒的，高濃度的甲醛能殺死細菌、病毒、真菌和寄生蟲[8]。Hoile等在研究電子設備的淨化處置時，分別使用γ射線和甲醛氣體兩種方法，結果發現γ射線劑量達到566Gy或者暴露於甲醛氣體50min以上時，可以看到炭疽桿菌孢子受到有效破壞。但是在電子數據恢復等恢復方面卻有極大差異，甲醛氣體法得到了預期的數據結果，而γ射線會損壞電子線路進而影響數據恢復[9]。由此可見，針對電子設備的去汙，應優選甲醛氣體法。
3證據的收集和保存
收集和保存法醫微生物學證據對於有效、成功的調查和溯源至關重要。
3.1證據的收集
3.1.1證據收集的方法
證據可以通過三種方法進行收集。一是收集整個物品並將其轉移到適當專用的生物防護設施，以便進一步採樣和分析。這種方法最大限度地縮短了證據收集所需的時間。二是調查人員可以移除部分物品，該方法主要適用於那些太大或太重而不能從犯罪現場移走的物品，或者擔心可能會在運輸過程遺失的痕跡證據。三是用適當的樣品收集裝置擦拭材料或表面，該方法對收集微量物質特別有用。
3.1.2樣品收集裝置的選擇
樣品收集裝置包括乾溼拭子、粘附器、高效空氣過濾器以及抽吸針。在某些情況下，收集多個樣本時，使用幾種不同的採樣方法以應對不同的分析方案可能是一種很好的做法。採樣方法和設備的使用應注意3個問題：第一，一些方法和採樣設備尚未經過嚴格驗證。不知道哪種方法和裝置能夠產生最佳的收集效率。第二，雖然許多方法已經被驗證，但是目前的安全限制可能會妨礙機構之間共享驗證數據。第三，由於細菌、真菌、病毒和毒素的多樣性以及分析物（如核酸或蛋白質）的穩定性不同，可能會導致採樣方法和使用設備的的不同[10]。
3.2證據的保存
3.2.1運輸介質的選擇
在臨床實驗室中，含有細菌的樣本傾向於在一般運輸介質（例如Amies或Stuarts）中運輸，其含有一些營養素以維持生存力。病毒運輸介質通常由溶液（如磷酸鹽緩衝蔗糖或Hanks平衡鹽溶液）、牛血清白蛋白和一些抗生素（用來延緩細菌生長）構成。不同濃度的甘油可以使某些病毒失活，同時保留其他病毒的活性[11,12]。適合農業病毒運輸介質的可能標準是中性的等滲溶液[13]。許多商業PCR或抗原檢測試劑盒提供了專門用於穩定分析物的專有運輸介質。也有一些通用的運輸解決方案來收集樣品進行PCR分析，溶解細菌或病毒並穩定核酸[14]。
3.2.2保存條件的選擇
對於食品的保存方法取決於食品的性質和包裝類型，以確保其完整性。為儘量減少運輸或保存對樣品的影響，應儘可能保持樣本乾燥、冷藏或冷凍。但是，一些微生物如果被冷凍可能會受到傷害。緩衝甘油可用於最大限度地減少凍結和融化造成的傷害[15]。
4證據的鑑定分析
生物證據一旦被收集和保存，應儘快、及時地送到實驗室進行分析。法醫微生物學專注於追蹤生物恐怖因子並試圖將其與個體或地點連接起來，根據攻擊的性質和收集的證據類型，可以實施不同的策略。
4.1免疫學方法
免疫學方法可以用來檢測病原體或毒素，是用抗體檢測病原體或毒素的特異蛋白，其優點是靈敏度高、速度快、易於實現自動化，主要有酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、和膠體金免疫層析(GICA)技術。張士堯將布氏桿菌、炭疽桿菌和肉毒毒素作為研究對象，製備出了純度較高的三種生物恐怖因子優勢抗原融合蛋白[16]。徐華等採用液相芯片技術平臺，通過優化偶聯抗體濃度和檢測抗體濃度、抗原抗體孵育時間等實驗因素，建立了4 種常見生物恐怖毒素液相芯片多重檢測方法[17]。
4.2分子生物學方法
4.2.1實時熒光定量PCR （Quantitative Real Time-PCR, qPCR）
qPCR是到目前為止在病原核酸擴增方面最為成熟的技術，可以用於檢測細菌和病毒的DNA，也可通過反轉錄檢測RNA病毒。但該方法僅適用於已知病原體，對於經過基因工程改造病原體和未知的病原體檢測，該方法則無能為力。qPCR SNP分析被開發用於法醫微生物學應用，目前已經確定了炭疽芽孢桿菌“Ames”基因簇（即2001年炭疽信件攻擊中鑑定的菌株）的六個SNPs[18]。
4.2.2重複序列PCR（rep-PCR）
重複序列已在許多細菌基因組中找到[19,20]，這些重複序列是穩定的，但其在菌種屬內和種屬間的拷貝數和在染色體上的位置是不同的。這種變異可以通過rep-PCR的程序進行檢測，以區分細菌種屬、亞種和菌株 [21]。但rep-PCR不像AFLP那樣隨意，因為其引物靶向已知的保守區域[22]。
4.2.3全基因組序列分析
利用全基因組序列分析，可以識別不同類型的基因變異，這將產生關於細菌基因組多樣性的全面信息，從而進行精細的源追蹤分析。這個全基因組變異分析方法被稱為全基因組測序分型。利用正在迅速發展的下一代測序技術能力，可以建立包含數百株細菌的全基因組序列的源追蹤數據庫[23]。
4.3其他方法
雖然核酸檢測的方法極為重要，但其不可能準確找出生物武器的來源。因此，需要對證據的化學和物理屬性進行分析以獲得更多信息。然而，對於微生物和汙染物的化學組成如何反映它們的生長環境，我們很缺乏瞭解，例如：與微生物多樣性和生長條件相關的同位素分析。化學和物理性質的匹配有助於確定不同事件的相關性，結果不匹配則證據可能具有排他性或者表示事件更復雜。
5信息化數據的運用
5.1數據庫建設
將現有的病原體和毒素的收集、儲存和運輸方法進行整合歸併形成方案，並錄入數據庫。數據庫可以對方法進行初步比較，以確定哪些方法得到充分驗證、哪些方法可能需要進一步驗證、哪些方法可能成功、哪些方法無效，這將減少重複工作，並允許科學家利用以前的知識來改進處理和分析方法。除了方案之外，數據還應包括樣本採集設備的信息、生物恐怖因子的類型、收集或回收的材料、儲存條件、運輸條件和媒介、解釋指南、長期存儲條件和支持驗證數據等。
5.2方法驗證
目前，有許多方法因沒有得到嚴格的驗證，而缺乏有效評估，這就限制了犯罪現場調查人員在制定行動計劃時作出最有效決定的能力，這對分析結果的後續解釋也會產生影響。應制定整個學科的驗證標準來指導現場調查人員和實驗室人員，這些標準應包括方法靈敏性、特異性、回收率和完整性對病原體或毒素分析檢測的影響。
5.3數據開發與共享
針對有機體類型（真菌、細菌、病毒或其他寄生蟲）或其他有機和無機材料等收集對象，不同部門之間的相關數據應當共享，以瞭解最有效的收集和回收工具以及最佳的儲存條件，對於改進操作計劃的制定、促進對有效特徵類型的識別以及將潛在抑制劑的影響最小化至關重要。瞭解公共衛生工作者在疫情調查方面取得的工作進展，也有助於調查生物犯罪（尤其是涉及食品的生物犯罪）。
6結語
生物犯罪就像一場沒有硝煙的戰爭，如何很好的應對生物犯罪，這是對全球各國政府提出的嚴峻挑戰。目前，我國法醫微生物學仍處於探索萌芽階段，距離發展和成熟尚有很長的一段路要走，我們應該在生物犯罪的識別、證據的去汙淨化、證據的收集和保存、證據的鑑定分析和信息化數據的運用五個方面著手，建立一套行之有效的應對生物犯罪的體系。
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