CRISPR/Cas9核酸酶可以形成特定序列的雙鏈DNA斷裂（DSB）。當細胞使用非同源末端連接（NHEJ）途徑修復這些基因時，會產生小的插入或刪除突變（indels）並擾亂基因。或者，DSB可以通過同源重組修復途徑（HDR）特異性改變鹼基，或者可以使用donor
vector來形成基因插入。由於CRISPR/Cas9易於構建和在人細胞中的毒性較低，在基因編輯中備受青睞。然而，由於iPSC不像普通腫瘤細胞系那樣具有總染色體異常和異常強烈的DNA損傷反應的特點，基因編輯在人類iPSC中成功率更低。CRISPR-U™採用了最大化基因組編輯效率的策略，我們在人類iPSCs中獲得的基因切割效率和同源重組效率比傳統方法提高10倍。
基因敲除
CRISPR-U™基因敲除iPSC細胞通過核轉染法將gRNA和Cas9轉入iPSC細胞中，藥篩完成後挑選單克隆培養。選擇不同的克隆分別進行靶位點擴增及測序驗證，篩選出基因敲除的陽性克隆。
應用案例
人T-iPSC分化的CD8αβ細胞在CD4/CD8雙陽性分化過程中，通過T細胞受體（TCR）α鏈的重排而失去抗原特異性。使用CRISPR/Cas9敲除T-iPSCs中重組酶基因（RAG2）阻止了這種額外的TCR重排。含有穩定的TCR的CD8αβ-T細胞在異種移植腫瘤模型能有效地抑制腫瘤生長。這些方法有助於安全有效的T細胞免疫治療。
參考文獻：
Minagawa, Atsutaka, et al. "Enhancing T cellreceptor stability in rejuvenated iPSC-derived T cells improves their use in cancer immunotherapy." Cell Stem Cell 23.6 (2018): 850-858.
基因點突變
CRISPR-U™基因點突變iPSC細胞
通過核轉染法將gRNA載體（含Cas9）和Donor共轉入細胞中，gRNA和Cas9複合物造成靶位點DNA雙鏈斷裂後，iPSC細胞以外源攜帶目標點突變的Donor作為模板進行同源重組修復（HDR），將目標點突變重組到基因組靶位點。
gRNA載體攜帶抗性，可進行藥篩，藥篩完成後挑選單克隆培養。選擇不同的克隆分別進行靶位點擴增及測序，篩選出點突變純合的陽性克隆。
· 細胞疾病模型建模
通過HDR，攜帶點突變序列的donor oligo (ssODN)替換WT對應的鹼基。
· 細胞疾病模型修復
通過HDR，攜帶WT序列的donor oligo (ssODN)替換對應的突變鹼基。
應用案例：
PSEN1基因A79V突變可引起阿爾茨海默症。研究表明，將阿爾茨海默症患者的體細胞誘導為多能幹細胞（iPSC），然後通過用野生型序列替換點突變序列，修正突變的基因。通過研究患者的iPSC和修正後的iPSC，可以得知該突變對細胞表型的影響，從而深入研究該突變的病理性作用。
用於修復A79V-hiPSC點突變的gRNA序列和ssODN。
· A 突變位點附近的基因組序列：紅色的T是需要被修正的核苷酸；黃色的是sgRNA識別位點，加粗的AA是Cas9的切割位點；粉紅色的是正反向引物。
· B Donor oligo序列, 綠色的C是修正後的核苷酸。
iPSC中PSEN1基因的序列分析。
· A 點突變修正後的雜合子測序結果。
· B 點突變修正後的純合子測序結果（T>C）。
參考文獻：
Pires, C., Schmid, B., Petræus, C., Poon, A., Nimsanor, N., Nielsen, T. T., ... & Freude, K. K. (2016). Generation of a gene-corrected isogenic control cell line from an Alzheimer's disease patient iPSC line carrying a A79V mutation in PSEN1. Stem cell research, 17(2), 285-288.
來源 | 源井生物
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