撰文 | 十一月
近日，以色列Weizmann Institute of Science的Itay Tirosh教授與美國Broad Institute的Mario L. Suvà教授在Molecular Cell雜誌上發表觀點文章Single-Cell RNA Sequencing in Cancer: Lessons Learned and Emerging Challenges，探討了單細胞測序技術尤其是RNA測序在腫瘤中的應用，和其所面對的挑戰。
對病人腫瘤切片標本的大量基因組和表達譜分析構成了我們對於癌症的大部分理解。然而，腫瘤並不是單一構成而是由多種細胞組成的錯綜複雜的“生態系統”，包括腫瘤細胞、免疫細胞和基質細胞等等，腫瘤的精確表徵被大量的基因組學分析方法所掩蓋。日前，單細胞基因組技術已經成為解析人類腫瘤中不同種類細胞的有效工具，為破譯癌症生物學中遇到的問題提供了令人信服的方法。因此，以下將對癌症中單細胞RNA測序的研究主題、遇到的機遇與挑戰以及新興的單細胞基因組學方法進行討論，為癌症生物學的研究提供新方法與新思路。
癌症是一種遺傳性疾病，惡性腫瘤的發生與內在因素和外在因素引起的基因異常表達息息相關。對癌症患者的生物樣本分析徹底改變了我們對於癌症的理解。基因表達譜的分析主要是由大量的數據與分析所主導，生物樣本的表達譜被描繪為單一均質的實體，然後把表達譜的平均量作為該樣品的表達譜。但是腫瘤內表達異質性（Expression intra-tumor heterogeneity，eITH）控制著腫瘤發展的許多關鍵方面，腫瘤細胞的驅動比如腫瘤生長、轉移與抗性的產生都受到腫瘤異質性的影響。惡性腫瘤的細胞異質性主要由三個因素決定：（1）遺傳異質性，由於腫瘤發育和進化過程中出現的突變，驅動多種細胞程序發生；（2）表觀遺傳與發育程序，例如在腫瘤幹細胞在分化過程使得癌症細胞具有可塑性；（3）細胞外的因素以及空間決定因子對於腫瘤細胞的氧氣供應、營養條件以及細胞-細胞之間的相互作用的影響。
單細胞RNA測序（Single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技術可以直接測量腫瘤樣品中細胞的轉錄輸出，並且測量的數據代表的是細胞將其遺傳、表觀遺傳和環境線索的整合，從而為科學家們提供線索確定癌細胞的適應性、行為和對治療的反應。因此，scRNA-seq研究將細胞生物學置於癌症生物學的中心，併為大量基因組研究提供不同的分辨率和視角。細胞類型、細胞狀態、惡性腫瘤和非惡性腫瘤細胞
對腫瘤中表達多樣性的分析通常分為兩個層面：一類是不同細胞種類，比如惡性腫瘤細胞、T細胞或者是成纖維細胞；另外一種則是不同細胞狀態，比如在相同的細胞週期、在相同的代謝狀態或者其他的可以作為聚類依據的細胞動態過程。隨後可以根據優先表達的基因作為註解細胞類型或者狀態的依據，比如大規模拷貝數改變（Copy number alterations, CNV），點突變和融合蛋白。最近scRNA-seq領域一個新興的研究主題是科學家們發現惡性腫瘤細胞表達譜的不同與腫瘤的來源更相關，而非惡性腫瘤細胞表達譜的聚類則主要是依據細胞種類而不依賴於樣本的來源【1-6】 。這表明：（1））惡性腫瘤的細胞間異質性通常大於任何特定類型的非惡性細胞；（2）對於惡性腫瘤細胞間異質性遠大於腫瘤內異質性。這些結果表現出相當程度的腫瘤間異質性，並且可能被誤解為反映癌細胞的腫瘤內異質性作用有限。單細胞方法給了我們進一步解析惡性腫瘤內部異質性的模式的利器，而這些異質性模式用先前的細胞生物學方法是難以評估以及分離分析。
癌細胞中復發異質性模式
在個體中觀察到的異質性模式是什麼樣的？首先，單個基因在細胞與細胞之間的表達水平都是不同的，一部分是因為基因表達的隨機性，另一部分是因為表達調控存在一些“噪音”。然而除了這種隨機性之外，基因組表達在細胞之間具有連貫性的變化，反映了具有不同生物學功能細胞的不同狀態。例如數十個細胞週期相關基因的表達說明某些細胞進入細胞週期而其他細胞在被分析的時刻並不在細胞週期之中【3,4】。類似地，如果與缺氧或者應激反應相關的許多基因上調這說明某些細胞正在通過這樣的反應來響應他們對微環境中營養元素或者氧氣缺乏的情況
【2-4】。這兩個過程——細胞週期與細胞應激反應——反映了腫瘤細胞內的異質性的常見模式，這些模式在不同的患者和不同的癌症類型中可以觀察到。除了那些“通用”的異質性模式之外，還存在特定的環境依賴模式，可能對給腫瘤定型提供更多信息。多項先前的研究發現，除了細胞週期和脅迫壓力存在之外，在特定癌症類型的多個患者中發現了特定的腫瘤內表達程序（即，在同一腫瘤中的惡性細胞中一致地變化的基因組），而這些表達程序並不存在於其他癌症類型（圖1）。最近，通過33種黑素瘤樣品的scRNA-seq分析鑑定了黑素瘤中促進免疫逃避和對免疫檢查點抑制劑具有抗性的癌細胞狀態【6】。在頭頸癌中，惡性細胞的上皮分化程序表達和上皮—間充質轉換程序的表達不同，對轉移有重要意義【5】。這些程序強調了假定的分化等級結構，與類幹細胞的自我更新和浸潤性增加相關。
圖1 惡性腫瘤細胞中異質性模式
這些初步結果表明了兩個重要結論。首先，惡性腫瘤的異質性模式對於腫瘤的維持和進展具有相當大的意義，需要進一步探索針對特定腫瘤亞群的分析方法。其次，這些模式在相同癌症類型或亞型的患者中的一致性表明這些模式反映了癌症起源相關的細胞基本特性。這些模式反映了癌細胞的“表觀遺傳圖景（Epigenetic landscape）”：每種類型的癌症細胞只能使用特定的程序。因此，細胞可動態激活那些“可接近的”程序，導致它們在個體腫瘤內的可變性。該模型表明，每種腫瘤或腫瘤亞型的程序可變性以及其對腫瘤細胞特性方面影響非常重要。
整合大量單細胞腫瘤表達譜
這些初步研究為腫瘤的單細胞表達譜的實用性提供了概念性的證明。然而，意識到這種方法的侷限性也很重要。首先，scRNA-seq僅提供細胞的部分取樣，高表達的基因相對於中等或者偏低表達的基因來說偏差較大。其次，scRNA-seq對樣品質量要求很高，因此不適用於保存處理不佳的臨床標本的分析。第三，高成本限制了對大量腫瘤樣本進行分析的能力，一般來說在每項研究中通常僅對少數樣本進行分析。鑑於單細胞方法和已經存在的綜合數據庫如癌症基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas , TCGA），預計單細胞數據庫並不會完全取代大量腫瘤分析數據，而是會與現有和新的數據進行批量整合以促進我們對腫瘤生物學的理解。
在過去，批量分析腫瘤細胞測序數據的時候忽略了這樣一個事實，由於每個剖面上的不同種群的存在對腫瘤微環境信號的分析會有誤。因此，許多最近的方法和研究都集中在通過對其體積分佈的去卷積來推斷腫瘤的組成【7】。此類方法通常需要對腫瘤細胞類型進行定義，而現在可以直接且準確地從scRNA-seq研究中獲得。在接下來的幾年中，預計這一趨勢將會擴大並且根據其測量或推斷成分對剖面進行批量分析將成為標準。一般來說，可以研究通過單細胞方法在腫瘤內鑑定的任何細胞亞群的預估丰度與批量樣品的相關性，從而部分地規避大小有限的單細胞群組。
單細胞癌症分析中的新挑戰和方向
在接下來的幾年中，利用scRNA-seq研究腫瘤的方法將進一步整合到癌症研究中，並將用於解決更多腫瘤生物學問題（圖2） 。以下將簡要介紹一些可能解決的主要問題，並指出scRNA-seq領域的新興技術將有助於這些研究。
圖2 利用scRNA-seq亟待解決的癌症生物學中的問題
區分遺傳與非遺傳機制的貢獻：單細胞多組學分析
遺傳異質性是腫瘤之內以及腫瘤之間產生多樣性的重要來源。但是越來越多的證據開始指向那些非遺傳學的機制之上。因此，區分相同的細胞中細胞狀態與遺傳狀態才能夠很好地區分這些機制。迄今為止，大多數的scRNA-seq的研究要不然是完全忽略了癌症細胞的遺傳狀態，要不然就只是評估了部分細胞的遺傳狀態。隨著近年技術的發展【8】，已能夠同時將細胞狀態與遺傳狀態相結合，為未來的腫瘤生物學提供更加綜合的觀點。目前，正在開發多組學的方法以將mRNA水平與各種其他特徵相結合，例如蛋白質水平、DNA甲基化、染色質可及性以及克隆擴增等等。這些方法提供新的方法論將腫瘤異質性的產生以及scRNA-seq推進到更高的水平。
細胞-細胞相互作用和空間位置：具有空間分辨的單細胞技術
每個腫瘤類似於生態系統，因此，每個細胞的狀態可能高度依賴於其精確的空間位置和與相鄰細胞的相互作用。這些複雜的相互作用及其對癌細胞生物學的影響仍然知之甚少。將轉錄組與空間信息偶聯將顯著提高預測和進一步表徵此類相互作用的能力，因此，正在開發許多方法以將scRNA-seq與空間信息耦聯。用於腫瘤分析的空間分辨技術的不斷改進以及來自不同技術的數據的整合，將在未來幾年內顯著推進這些方向，並提高我們對細胞-細胞相互作用以及空間效應的理解。腫瘤微環境的複雜性意味著這種潛在相互作用的數量很大，需要進行後續研究以確定個體相互作用的重要性。
殘留腫瘤與腫瘤復發：冷凍樣品分析
在許多癌症類型中，治療反應通常伴隨著腫瘤的侵襲性增加以及抗藥性腫瘤的復發，突出了研究殘餘腫瘤進展和生長對於複發性腫瘤出現的重要性。前人的研究比較了原發性和複發性腫瘤的不同點並揭示了耐藥性的各種遺傳原因【9】。未來的研究將擴展這種方法並通過scRNA-seq進行比較，提供複發性腫瘤的更詳細視圖及其與相應原發性腫瘤之間的差異。一個很大的挑戰是目前的scRNA-seq需要的新鮮腫瘤樣本，在已經給定復發時間的情況下同時處理匹配的原發與複發性腫瘤樣本困難極大。然而，目前已有多種方法可以實現冷凍樣品的分析，從而能夠對不同的樣品集合進行對比。
腫瘤亞群：檢測、功能與起源
腫瘤進展是一個進化過程，少數細胞足以通過選擇逐漸出現新的表型。因此，關鍵亞群如癌症幹細胞、耐藥細胞和構成轉移的遷移細胞可能反映了一種非常罕見的亞群（例如小於0.1％的細胞亞群），這種亞群逃脫了大多數方法的檢測，包括目前的scRNA-seq方法。未來的技術可能會幫助發現獨特的亞群。一旦發現了獨特的亞群，即需要進一步確認其功能和臨床意義。主要由兩種方法可以進一步分析這些亞群。首先，大批量的研究將揭示亞群的存在頻率與臨床特徵之間統計相關性。第二種方法將依賴於scRNA-seq對這些亞群的詳細表徵，以鑑定出能夠分離這些亞群的標記物以及在動物模型或者細胞中進一步進行功能研究。但需要提出的一個警告是已建立的腫瘤的scRNA-seq無法識別突變首次發生“突變細胞”， “突變細胞”可能與產生腫瘤的細胞不同。惡性腫瘤細胞和正常細胞之間的比較不僅突出了相似性，還提供了腫瘤細胞與其假定的起源細胞之間的差異，從而增加了我們對致癌過程的理解。
獨特的腫瘤表型：隊列N = 1的單細胞分析
雖然治療決策是基於大群體中的統計，但異常的腫瘤表型也非常常見且更加難以解決。在過去，這些病例的獨特表型很難理解因為大多數的表型主要通過大量遺傳分析進行研究。然而，scRNA-seq以及上述相關的技術改使得能夠以前所未有的深度和廣度來表徵腫瘤生態系統。鑑定獨特的腫瘤表型是非常重要的工作，因此隊列N=1的scRNA-seq對此研究會很有意義。由於極端表型通常是後期檢測到的，因此這種方法也可以用於對已存檔的冷凍樣本的分析。
結束語
長期以來，腫瘤異質性使癌症生物學家和臨床醫生感到困惑。由於缺乏準確測量腫瘤中單個細胞的基因組工具，科學家們傾向於依賴腫瘤細胞群體的平均測量結果或者是單個細胞標記實驗，因而掩蓋了腫瘤異質性的許多關鍵方面並阻礙了我們對腫瘤生物學的理解。測量轉錄輸出作為細胞類型和遺傳學功能方面的標記，為重新理解癌症起始和進化奠定了基礎。雖然對腫瘤異質性的瞭解最初可能看起來令人生畏，但是新的腫瘤細胞狀態的細胞過程正在被大規模的研究，將會有更多的腫瘤細胞發生過程中的漏洞可用於探討癌症的治療方案。
人類癌症單細胞基因組學是一個時代的開始，為更多的發現鋪平了道路，同時為更廣泛的臨床應用提供了大數據的參考。製版人：珂
參考文獻
1. Ferreri, A. J., Illerhaus, G., Zucca, E., Cavalli, F. & International Extranodal Lymphoma Study, G. Flows and flaws in primary central nervous system lymphoma. Nature reviews. Clinical oncology 7, doi:10 1038/nrclinonc 2010 1039-c1031; author reply doi:1010:1038/nrclinonc 2010 1039-c1032, doi:10.1038/nrclinonc.2010.9-c1 (2010).
2. Patel, A. P. et al. Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma. Science 344, 1396-1401, doi:10.1126/science.1254257 (2014).
3. Tirosh, I. et al. Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma by single-cell RNA-seq. Science 352, 189-196, doi:10.1126/science.aad0501 (2016).
4. Tirosh, I. et al. Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature 539, 309-313, doi:10.1038/nature20123 (2016).
5. Puram, S. V. et al. Single-Cell Transcriptomic Analysis of Primary and Metastatic Tumor Ecosystems in Head and Neck Cancer. Cell 171, 1611-1624 e1624, doi:10.1016/j.cell.2017.10.044 (2017).
6. Jerby-Arnon, L. et al. A Cancer Cell Program Promotes T Cell Exclusion and Resistance to Checkpoint Blockade. Cell 175, 984-997 e924, doi:10.1016/j.cell.2018.09.006 (2018).
7. Aran, D., Hu, Z. & Butte, A. J. xCell: digitally portraying the tissue cellular heterogeneity landscape. Genome biology 18, 220, doi:10.1186/s13059-017-1349-1 (2017).
8. Macaulay, I. C. et al. G&T-seq: parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes. Nature methods 12, 519-522, doi:10.1038/nmeth.3370 (2015).
9. Kim, C. et al. Chemoresistance Evolution in Triple-Negative Breast Cancer Delineated by Single-Cell Sequencing. Cell 173, 879-893 e813, doi:10.1016/j.cell.2018.03.041 (2018).
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