最新研究發現，約1/3的晚期癌症患者都會發生骨轉移，骨癌痛也成為癌症患者最常見的一種疼痛，嚴重影響了患者的生活質量。雖然隨著醫學科學的發展，治療骨癌痛的手段越來越多，但由於存在療效短暫和藥品不良反應等問題，仍有相當一部分骨癌痛得不到理想控制。限制新型療法出現的關鍵在於骨癌痛發病機制現在仍不是很清楚。長期以來缺乏可靠的動物模型，阻礙了對骨癌痛發生機制的研究及新型鎮痛療法的研發。
直到1999年， Schwei等首次報道了一種小鼠股骨骨癌痛模型。後來Medhurst等又建立了一種世界範圍內認可的大鼠脛骨癌痛模型。模型的建立為認識人類骨癌痛的發病機制及治療研究提供了很好的工具。但在國內，由於受到各個實驗室條件及造模用細胞株來源的限制，骨癌痛模型複製仍然是相關課題研究的瓶頸。本章將詳細地介紹一種改良版Medhurst大鼠脛骨骨癌痛模型方法。接種細胞後，採用自身對照的方法比較其前後疼痛行為學的變化，在通過X線攝片、HE染色切片證實有無骨損害的發生，來評價檢驗模型建立是否成功，為骨癌痛相應的一系列研究提供一個適用的工具。
第一節 實驗設備及試劑
一、實驗設備
實驗設備包括光熱尾痛測試儀、足底測痛儀、倒置顯微鏡(DMI6000B)、自動組織包埋機(ZMN-7803)、電熱恆溫水浴箱、恆溫乾燥箱、微波爐、冰箱(BCD-203)、光學顯微鏡(BX41TF)、組織切片機(Leica2135、2145)、微量進樣器(5μl)、移液器(1ml)、無菌操作檯。
二、主要試劑
Gibco胎牛血清，75％乙醇，0.01moL/L PBS，生理鹽水，無菌骨蠟，4％多聚甲醛，PBS固定液，10％、20％、30％的蔗糖，冰凍切片包埋劑，切片保護劑，3.6％水合氯醛，0.25％胰蛋白酶，免疫抑制劑，2.5％頭孢噻肟鈉。
三、實驗試劑的配製
(一)0.01mol/L PBS的配製
NaCl 8g
Na2HPO4·12H2O 3.634g
KCl 2g
KH2PO4·2H2O 0.24g
(1)稱取以上試劑量。
(2)準備容量為1000ml的燒杯盛約800ml的去離子水，依次加入所稱取試劑。
(3)玻璃棒攪拌使其充分溶解，最後定容至1000ml。
(二)0.25％胰蛋白酶的配製
(1)準備一個清洗乾淨且乾燥的容量為200ml的燒杯。
(2)在電子天平上稱量胰蛋白酶0.25g，溶解在100ml的0.01mol/L PBS中。
(3)0.2μm濾膜過濾，分裝，儲存在-20℃冰箱備用。
(三)免疫抑制劑的配製
環孢素一支，規格250mg 5ml，用生理鹽水稀釋10倍，變成250mg 50ml，濃度5mg/ml。
(四)3.6％水合氯醛
稱取水合氯醛3.6g，單蒸水定容至100ml，混勻後封口備用。
(五)4％多聚甲醛-PBS固定液
取40g多聚甲醛溶解於800ml 0.01mol/L PBS，放於60℃恆溫水浴鍋中溶解後定容至1000ml。
(六)2.5％頭孢噻肟鈉
1g頭孢噻肟鈉用40ml生理鹽水配製成濃度為2.5％的溶液。
四、實驗所需其他器具
(一)實驗器具
倒置顯微鏡、恆溫水浴鍋、CO2培養箱5ml注射器、10ml注射器針頭、組織剪、線剪、彎鉗、有齒鑷、無齒鑷等。
(二)細胞培養用具
封口膜、75％酒精棉球、酒精燈、15ml離心管、6孔細胞培養板、1ml無菌槍頭、1ml移液器等。
第二節 實驗方法
一、體外大鼠乳腺癌細胞株MRMT-1培養
(一)MRMT-1細胞復甦
(1)將預熱的培養液放到臺上。
(2)穿好無菌手術衣，戴好手套、口罩、帽子，75％酒精棉球消毒手套。
(3)撕開無菌6孔細胞培養板包裝，放入臺上，並從飯盒內取出15ml離心管放到架子上。
(4)撕去培養液的封口膜，75％酒精棉球擦拭瓶口，過火，在離心管中加入9ml培養液。
(5)培養液瓶口及瓶塞過火，並蓋好。
(6)從-150℃冰箱中取出裝有要復甦的細胞凍存管，插入漂板，在37℃恆溫水浴鍋中游走晃動，將其迅速解凍。
(7)將解凍的細胞放到臺上，75％酒精棉球消毒雙手，用75％酒精棉球擦拭凍存管的管口部位，過火，將瓶蓋打開，過火，將凍存的含細胞培養液吸出，加入含有9ml培養液的15ml離心管中，馬上離心，1000r/min離心10min，去上清液。
(8)再向其中加入12ml新的培養基(血清為澳洲源血清)，混勻後，接種到培養板中；並在倒置顯微鏡下觀察：細胞懸浮均勻分佈。
(9)放入37℃、5％CO2培養箱進行培養。
(二)細胞傳代
(1)在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，發現細胞已經佔據整個培養板每孔的80％～90％，開始傳代。
(2)準備實驗所需要的乙醇和酒精棉球，並將使用的培養液放入恆溫培養箱預熱。
(3)紫外燈消毒實驗臺30min。
(4)戴帽子、口罩，並穿上隔離衣，戴手套；將打包消毒的槍頭盒和EP管放入超淨臺，準備開始傳代。
(5)將要凍存的細胞培養板和預熱的培養液從培養箱中取出，放進剛噴灑酒精的超淨臺上，用酒精棉球擦手消毒。
(6)去掉盛有培養液的瓶子口的封口膜，用酒精棉球擦瓶口和瓶蓋的連接處，酒精燈外焰過火，放在酒精燈左側。
(7)揭開培養板，蓋朝下放置，拿起培養板，與超淨臺平面成45°角，用移液槍貼住每個培養孔下邊吸取培養液丟棄，用PBS沖洗1次，去掉PBS，加0.25％胰酶消化，剛好覆蓋過細胞為止，蓋上蓋子，室溫消化2～3min。
(8)用帶血清的培養液終止消化，開始輕輕吹打，使貼壁的細胞懸浮起來。
(9)收集到離心管中，離心細胞，1000r/min離心10min。
(10)去掉培養基，加入新的培養基12ml，製成細胞懸液，進行細胞計數。
(11)將細胞懸液稀釋至2×100000個/ml的細胞密度進行接種。
(12)置入37℃、5％CO2的培養箱進行培養。
二、骨癌痛模型的複製
參考Medhurst等報道的方法，建立大鼠骨癌痛模型。
(1)選擇清潔級成年雌性SD大鼠20只，隨機分為兩組，假手術組(對照組)和骨癌痛模型組(實驗組)。
(2)腹腔注射3.6％水合氯醛1ml/100g，麻醉起效後，取仰臥位固定。
(3)左側後肢剪毛，皮膚用碘伏消毒，鋪無菌洞巾。
(4)在脛骨上段(膝關節下約5mm)皮下組織最薄處切開1cm小口，鈍性分離皮下組織，小心暴露脛骨。
(5)用10ml注射器針頭分開局部骨膜，垂直於術區脛骨骨面鑽孔，以食指托住脛骨對抗鑽孔用力，儘量保持後肢膝關節屈曲功能位，避免牽拉，有突破感提示已進入骨髓腔。
(6)用10μl微量注射器緩慢注入3μl含3×1000個的MRMT-1大鼠乳腺癌細胞，注射完畢後用無菌骨蠟仔細封堵針孔。假手術組注入等量生理鹽水。
(7)生理鹽水清洗創口，皮膚縫合。
(8)術後抗感染(2.5％頭孢噻肟鈉)治療。
三、骨癌痛模型的評價
評估大鼠不同時期的疼痛行為學(術前1天、術後1周每週溫痛覺檢查，至術後4周；成都市高新區四川大學轉化醫學中心測試大鼠下肢機械壓痛覺和尾部溫熱痛覺閾值，實驗過程中保持室內安靜)、局部組織學、影像學改變(術後4周取材做脛骨X線及HE染色)，以確保模型複製成功。
(1)大鼠機械痛覺檢測：足底測痛儀檢測砝碼為20g，標尺刻度0～25，壓爪質量＝標尺刻度×20g，大鼠左右下肢分開測定，測定時將其下肢掌中部放在平臺上，然後開始測定，緩慢移動測試標杆直至壓力達到一定閾值時大鼠將其下肢抽回，記錄此時的標尺刻度，共測4次，每次測試相隔1min以上，第1次數據不計，後3次數據求平均值。
(2)大鼠熱痛覺檢測：將光熱尾痛測試儀紅外燈強度設為80℃，時間閾值為22g，每隻大鼠放入固定器後不能立即進行熱痛覺檢測，一般先讓其安靜1min左右然後開始檢測，測定時將大鼠尾部後1/3處放在紅外燈處，按開始鍵後，開始計時，當熱刺激到一定閾值時大鼠尾巴擺動，離開紅外燈處，計時立即停止，讀取此時的時間。共測4次，每次測試相隔1min以上，第1次數據不計，後3次數據求平均值。
四、統計方法
採用SPSS 16.0統計軟件分析，數據以x-±s表示，組間比較採用單因素方差分析，組內不同時間點的比較採用重複測量資料的方差分析，P<0.05表示差異有統計學意義。
第三節 實驗結果
一、疼痛行為學改變
如圖23-1所示，假手術組大鼠與骨癌痛組大鼠術前機械痛縮爪閾值無差異(P>0.05)，假手術組大鼠術前機械痛縮爪閾值與術後7d、14d、21d、28d相比略呈下降趨勢，但無統計學意義(P>0.05)。骨癌痛組大鼠術後7d、14d、21d、28d與術前相比下降顯著，有統計學差異(P<0.05)，與同時間假手術組相比也明顯下降，有統計學差異(P<0.05)。大鼠熱痛甩尾閾值呈現相同的變化趨勢(圖23-2)。
二、X線檢查結果
大鼠脛骨X線片如圖23-3所示，大鼠腫瘤細胞注射側脛骨出現明顯的骨質破壞，骨質破壞的程度與造模時間呈正相關，時間越長，破壞越重。到第28天，骨質破壞進一步加重，骨皮質呈蟲食狀缺失。而假手術組脛骨x線照片未顯示明顯的骨質破壞。圖23-3是大鼠下肢脛骨平臺處X線片，顯示下肢脛骨平臺處局部骨質密度減低，骨小梁稀疏，正常骨結構消失，單側骨皮質缺失。
三、組織學觀察結果
圖23-4為骨癌痛大鼠脛骨石蠟切片、蘇木素-伊紅染色(HE染色)，顯示造模大鼠骨髓腔有腫瘤細胞(白色箭頭)及大量破骨細胞(黑色箭頭)。
第四節 經驗體會及注意事項
(1)細胞培養過程要嚴格無菌操作，在超淨工作臺上完成實驗操作。這對於細胞的復甦和傳代十分重要。
(2)大鼠手術操作中去毛、無菌操作和術後抗感染對於模型的建立是必不可少的。要絕對杜絕術後手術部位的感染，如果手術部位出現炎性感染，會出現炎性痛，嚴重干擾正常結果。
(3)脛骨鑽孔時，儘量選擇皮下組織和肌肉少的部位，將皮下組織、骨膜與穿刺部分骨面分離完全，避免軟組織夾入鑽孔中。如果皮下組織和肌肉過多，在分離和暴露的過程中損傷嚴重，會產生疼痛，干擾正常結果。
(4)穿刺時一定要垂直骨面，儘量減少對脛骨骨質的破壞，否則脛骨的抗壓能力受損。容易發生穿刺處骨折。
(5)術後必須仔細進行無菌骨蠟密封，以防腫瘤細胞自穿孔處外逸。骨髓腔內壓力增高是形成骨癌痛的原因之一，腫瘤的外向生長，減輕了骨髓腔內壓，緩解了疼痛，不利於實驗檢測。
(6)痛閾水平檢測屬於感覺檢測，易受外界因素干擾，所以進行行為學測痛檢查時，一定要保持環境安靜，並且給大鼠一定時間適應檢測所處的環境，以保證檢測的穩定性。
(7)組織固定的好壞是影響免疫組化結果的關鍵因素。組織標本離體後30min內應放入固定液或低溫保存，最佳的固定液應該是中性甲醛溶液，固定時間為12～24h。中性甲醛溶液滲透力強，固定均勻，對組織收縮小，無論是對HE切片還是免疫組化都是最好的固定液。
關於我們
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諾恩諾德比較醫學中心負責人黎立博士，原為中國人民解放軍總醫院第八醫學中心比較醫學中心（實驗動物中心）負責人，曾參與國家“十二五”、“十三五”專項課題10餘項，曾參與國家自然科學基金項目20餘項，曾參與完成國家自然科學基金課題10餘項，參與完成軍隊科研課題20餘項；獲得國家發明專利8項，發表學術論文30餘篇。
黎立博士師從鄭兆榮教授，鄭兆榮教授為吉林大學（中國人民解放軍農牧大學）教授、病理解剖學教研室主任、第六屆全國政協常委，長期從事病理形態學的研究。同時，黎立博士也與臨床醫學相關院士保持著良好的合作關係。
未來，諾恩諾德比較醫學中心將在CRO服務、PDX的臨床應用與研究、腫瘤技術與產品的開發、藥品、特醫食品、醫療器械的研發中，獲得更大的成績，並將為公司在發明專利、課題申報方面做出貢獻。
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