撰文 | 木蘭之枻
CRISPR-Cas系統為基礎研究和臨床轉化應用中正展現出強大的實力和無窮的潛力，其中應用最為廣泛的SpCas9系統能與sgRNA形成複合物切割靶位點引入DNA雙鏈斷裂（DSBs），之後由非同源重組修復（NHEJ）途徑誘導插入缺失突變，或在DNA修復模板的存在下通過同源重組修復（HDR）途徑實現精準基因編輯；此外，以CRISPR-Cas9為基礎的各種新工具也不斷湧現，其中，通過融合不同脫氨基酶獲得的單鹼基編輯系統CBE（Cytosine Base Editor）和ABE（Adenine Base Editor），可分別實現C·G--T·A鹼基對的轉換和A·T--G·C鹼基對的轉換，這對上述的近半數點突變遺傳病的治療有重要意義，因而在基因治療領域的應用前景相當廣闊。不過，CRISPR-Cas系統對靶位點的識別受限於特定的PAM識別序列：以SpCas9為例，其僅能識別編輯PAM序列為NGG的基因組位點，因而極大的限制了其應用。
長期以來，研究者們致力於優化升級Cas9蛋白，以拓展其對不同PAM序列的兼容性，並期望有朝一日能擺脫PAM序列困擾，讓Cas9擁有全基因組範圍內的編輯能力。以SpCas9為例：Keith Joung實驗室最早於2015年便通過易錯PCR策略獲得可識別NGA的SpCas9-VRQR突變體及NGCG的SpCas9-VRER突變體【1】。2018年，
David Liu實驗室利用其獨有的定向演化技術PACE構建出可識別NGG、NG、GAA和GAT的xCas9 3.7變體（詳見BioArt報道：特別推薦丨基因魔剪CRISPR/Cas9新進展——新型利器xCas9 3.7利刃出鞘）【2】；同年Nureki實驗室構建出活性更強的SpCas9-NG變體，其識別的PAM序列拓展至NG【3】。2020年，David Liu實驗室利用PACE技術更進一步，其構建出的一系列SpCas9突變體識別的PAM序列拓展至NRNH（R為A/G, H為A/C/T），這一系列的工作讓SpCas9及其突變體幾乎擺脫了PAM困擾【4】（圖1）。
圖1 各種SpCas9突變體所識別的PAM序列特徵 （改自【4】）
2020年3月27日，來自哈佛醫學院和麻省總醫院的Benjamin P. Kleinstiver（【1】的一作）實驗室在Science雜誌上發表了題為Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants的論文。文章再度對SpCas9蛋白進行了強勢升級，改造後的SpCas9突變體SpRY幾乎完全擺脫了PAM困擾，其識別的PAM序列涵蓋NRN和NYN（Y為C/T）（NRN > NYN）。SpRY和以此為基礎構建的單鹼基編輯系統在PAM為NRN的位點處展現出強大的編輯能力，而在PAM為NYN的位點處的編輯能力雖然有所降低，但依然可觀。
根據SpCas9的結構特徵以及2015年報道的可識別PAM序列為NGA的SpCas9-VRQR突變體（D1135V/G1218R/R1335Q/T1337R），研究者推測包含R1335Q突變及其它位於PI結構域的突變是拓展PAM識別位點的基礎，因此研究者將在SpCas9-VRQR的基礎上進一步拓展PAM識別位點。為研究PI結構域各類點突變對PAM識別位點的影響，研究者設計出一種高通量PAM分析法HT-PAMDA以系統性分析SpCas9突變體文庫的PAM偏好性。通過HT-PAMDA分析，研究者發現一種突變體SpG（D1135L/S1136W/G1218K/E1219Q/R1335Q/T1337R） 可識別的PAM序列為NG，其對NGA、NGC、NGT和NGG並無明顯偏好性。而後，針對PAM序列為NGNN的78種位點，研究者通過細胞實驗對野生型SpCas9、xCas9 3.7、SpCas9-NG和SpG的PAM偏好性和編輯活性進行比較，發現SpG在各類PAM序列處的表現最為穩定。此外，以SpG為基礎構建的單鹼基編輯系統SpG-CBE和SpG-ABE在各類PAM序列處的單鹼基編輯活性也最為穩定。
從結構上而言，R1333Q突變或可使得SpCas9識別PAM序列為NAN的位點，然而SpG（R1333Q）在PAM序列為NRN的位點處的編輯活性甚微；不過研究者發現，L1111R和A1322R突變可恢復SpG（R1333Q）的部分編輯活性。隨後通過結構分析、HT-PAMDA實驗和細胞實驗，研究者發現SpG（L1111R/A1322R）+A61R/N1317R/R1333P在PAM序列為NRN和部分NYN位點處擁有最佳的編輯活性，該突變體也被命名為SpRY。而後，研究者通過細胞實驗對SpRY及相關的單鹼基編輯系統SpRY-CBE和SpRY-ABE在各類不同的PAM序列處的編輯活性進行系統分析，證實SpRY的編輯能力幾乎擺脫了PAM困擾，其識別的PAM序列特徵為NNN（NRN > NYN）（圖2）。
圖2：SpRY在不同PAM序列處的編輯活性
之後，研究者還證實，高保真版本的SpCas9-HF1突變體可以和SpG及SpRY兼容，從而獲得不受PAM限制且安全性高的SpG-HF1和SpRY-HF1突變體。有了如此強大的SpG和SpRY工具及衍生的SpG/SpRY-CBE及SpG/SpRY-ABE，研究者能更加自如精準的誘導各種點突變。
總體而言，本研究開發的SpCas9突變體SpRY是當前對PAM序列兼容性最高的SpCas9突變體，幾乎完全擺脫了PAM序列的限制，其在基因組範圍內的編輯能力得到了極大的提高，而衍生而來的單鹼基編輯系統讓精準編輯幾乎拓展至全基因組範圍。
原文鏈接
https://science.sciencemag.org/content/early/2020/03/25/science.aba8853
參考文獻
1. Kleinstiver, B. P. et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature 523, 481–5 (2015).
2. Hu, J. H. et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature 556, 57–63 (2018).
3. Nishimasu, H. et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science 361, 1259–1262 (2018).
4. Miller, S. M. et al. Continuous evolution of SpCas9 variants compatible with non-G PAMs.
Nature Biotechnology (2020).閱讀更多 BioArt 的文章
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