腦脊液是動物實驗研究中經常用到的標本，在腦損傷機制、生物標誌物、藥物治療等研究領域有著不可替代的研究價值，但是鼠的腦室及蛛網膜下腔狹小，其內血管又很豐富，導致腦脊液提取過程複雜，且容易刺穿延髓致使大鼠死亡，因此腦脊液採集的低成功率成了許多研究者面臨的技術難題。本研究通過查閱文獻，並在以往報道的腦脊液採集方法的基礎上加以改進，為無腦脊液採集經驗的初學者提供了一種準確、方便、快速、無血汙染的大鼠腦脊液收集技術。
一、實驗材料
1.實驗動物 選取SD大鼠20只，體重300～400g，由上海實驗動物中心提供。
2.實驗器械 腦立體定位儀，微量進樣器(100μl)，水合氯醛，手術器械，冷凍離心機(CT15RE)。
二、實驗方法與結果
(一)實驗方法
7％水合氯醛腹腔麻醉大鼠。動物麻醉後，將腦立體定位儀耳杆緊貼雙耳分別插入兩外耳道，固定耳杆於主框上，並使兩側耳杆讀數相同。將大鼠的上門齒勾住門齒杆，固定上頜。將門齒杆升高。使大鼠頭部與軀體約成135°(圖24-1)。於大鼠頭枕部剪毛、消毒，沿後正中線切一縱行切口(1.5～2cm)。打開皮膚後，會看見枕骨隆凸後有一倒三角形的肌肉間隙，用微量進樣器的針尖部抵住三角形凹陷的底部沿後正中線下滑，至枕骨大孔後進針，針尖斜面向上，並與身體平行，即針與頭部的角度約為135°(圖24-2)。注意進針速度不宜過快。當針尖透過黃韌帶時，有明顯的落空感。此時針尖即進入延髓池(深度約0.2mm)。停止進針。左手固定針頭部不動，右手緩慢抽取腦脊液，此時應注意抽取速度一定要慢，否則容易出現血性腦脊液。抽取後迅速退針，將腦脊液移入0.5ml的 EP管中，離心後於液氮或者乾冰中速凍並移入-80℃冰箱保存。腦脊液收集後，動物可根據需要於皮膚縫合後繼續飼養或者處死進行後續取材研究等。
(二)判斷標準
將收集到的腦脊液於20min之內，4℃、2000g離心10min。如果腦脊液為淡紅色，表明是血性腦脊液併發生溶血：如果EP管底部有紅色沉澱，表明是血性腦脊液，但未發生溶血。出現血性腦脊液的樣品判為不合格。
(三)結果
在20只大鼠中，成功抽取腦脊液的有18只，離心後腦脊液呈清亮透明狀，未出現紅色沉澱現象。一般一隻大鼠可抽取80～120μl腦脊液，體重稍大的大鼠能抽取到120～140μl腦脊液。有2只出現了血性腦脊液，但離心後仍能獲得80μl以上的清亮腦脊液。
三、討論
由於腦脊液成分可以間接地反映腦組織的情況，因此腦脊液中相關成分的分析是動物實驗中經常用到的技術。但是由於腦脊液採集方法和技術的限制，常常成為動物實驗研究中的難題。如何能在採集充足腦脊液的情況下避免血性汙染成為腦脊液成功抽取的關鍵。 在眾多以往報道的腦脊液採集方法中。血性腦脊液的出現往往是困擾研究人員的關鍵問題。特別是對於初學者來說，快速掌握一種有效的腦脊液採集方法是開展後續研究的關鍵。目前國內外報道的採集腦脊液的方法主要有以下幾種：經皮直接穿刺延髓池抽取法、直視下經硬脊膜穿刺延髓池抽取法、直視下劃破硬脊膜抽取法等。
筆者研究小組在既往報道的基礎上，將抽取方法做了調整，建立了更適合初學者的方法。該方法與直接經皮抽取腦脊液的方法相比，微量進樣器抽取的位置更容易掌握，減少了操作偏差。該方法與打開皮膚和肌肉，直視狀態下抽取腦脊液的方法相比，由於只是將皮膚剪開，避免傷及肌肉，因此減少了因肌肉出血而導致汙染的可能性。同時對於初學者來說，由於不熟練而出現第1次進針未能順利抽出腦脊液的情況時，由於肌肉的收縮和封閉功能，可以在第2次或者第3次調整針頭方向或者位置。避免了在直視狀態下第1次未能成功抽出腦脊液，退針後腦脊液外流嚴重而不能再次抽取無汙染樣本的情況。另外，當動物需要繼續飼養時，只打開皮膚經肌肉穿刺延髓池抽取腦脊液的方法與打開皮膚和肌肉直視狀態下抽取法相比，其具有有創範圍小、動物恢復快等顯著優點。
綜上所述，作者經過探索建立的打開皮膚經肌肉穿刺延髓池抽取腦脊液的方法具有簡單、快捷、高效等優點，是一種較好的採集腦脊液的方法，尤其適用於無腦脊液採集經驗的初學者。
來源：《神經疾病動物模型製備理論與技術》
關於我們
諾恩諾德醫學研究院（北京）有限公司比較醫學中心（以下簡稱“諾恩諾德比較醫學中心”），是我院非常重要的一個臨床前研究機構與實驗中心。它為公司CRO業務的承接、為公司腫瘤技術與產品的開發、為PDX的的臨床的應用與研究提供了保障和基礎。
諾恩諾德比較醫學中心負責人黎立博士，原為中國人民解放軍總醫院第八醫學中心比較醫學中心（實驗動物中心）負責人，曾參與國家“十二五”、“十三五”專項課題10餘項，曾參與國家自然科學基金項目20餘項，曾參與完成國家自然科學基金課題10餘項，參與完成軍隊科研課題20餘項；獲得國家發明專利8項，發表學術論文30餘篇。
黎立博士師從鄭兆榮教授，鄭兆榮教授為吉林大學（中國人民解放軍農牧大學）教授、病理解剖學教研室主任、第六屆全國政協常委，長期從事病理形態學的研究。同時，黎立博士也與臨床醫學相關院士保持著良好的合作關係。
未來，諾恩諾德比較醫學中心將在CRO服務、PDX的臨床應用與研究、腫瘤技術與產品的開發、藥品、特醫食品、醫療器械的研發中，獲得更大的成績，並將為公司在發明專利、課題申報方面做出貢獻。
閱讀更多 諾恩諾德醫學研究院 的文章
