PCR作為老生常談的一種實驗技術，對實驗新手而言卻仍是一個不小的挑戰，比如引物設計、預測脫靶效率、PCR中的疑難雜症等等，其中任何一個問題都足以讓他們頭疼一陣。
而本文推薦的9個PCR常用網站，囊括了PCR全方位攻略，你想知道的PCR相關問題都可以在這裡找到答案！另外再教大家如何一招看懂PCR結果圖！
九個PCR常用網站
1、引物設計在線軟件--Primer3
網址：
http://primer3.sourceforge.net/webif.php
Primer3是一個非常簡單卻高效的引物設計在線軟件，你只需在目標序列中粘貼DNA序列後點擊搜索即可。可通過多種方式來對結果進行篩選，包括PCR產物的大小、引物大小、Tm範圍和其他參數。同樣，還可使用Primer3來設計用於PCR-ELISA的雜交探針和其他基於探針的PCR引物設計。
2、減少非靶向擴增--NCBI
網址：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
NCBI網站的用途遠不止於搜索文獻和BLAST。在Primer Blast中，可搜索到合適的引物對（該功能類似於Primer3）或者在輸入特異性引物序列後，利用Primer Blast來檢測其特異性，進而減少非靶向擴增。在全基因組DNA中，如果你想擴增多基因家族中的一個基因，那麼對靶基因的引物進行blast會提高PCR反應的特異性。且該方法也可擴增質粒上的靶標，並降低產生非特異性PCR產物的風險。
3、定期進行PCR和克隆--Serial Cloner
網址：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
如果你需要定期進行PCR和克隆，那麼這個軟件絕對值得擁有，可下載適用Mac和Windows操作系統的免費軟件。一旦你安裝了程序並保存了你的DNA和引物序列，就可以運行虛擬PCR，查看限制性位點，進行酶切測試（甚至可以添加你的分子量標記來了解你的瓊脂糖凝膠應該如何看待！），執行序列比對等等。Serial Cloner還可用來製作能放在PPT甚至文章中的克隆質粒圖譜。
4、操作PCR反應和實時PCR實驗
網址：https://sg.idtdna.com/country.aspx
儘管這不是一個只針對PCR的網站，但是可以在其中找到很多非常有用的工具來幫你操作PCR反應和實時PCR實驗。比如，計算引物和擴增子的一般性質或者依據具體需求來設計特異性的寡核苷酸等。值得一提的是，該網站還會提供一些稀釋底物方法，以解決實驗中瑣碎的稀釋計算方法。
5、找有關qPCR的所有知識
網址：
http://gene-quantification.info/
這個網站是由創建qPCR相對定量Pfaffl法的Michael P.Pfaffl編輯的，對於qPCR實驗新人來說，可能是一個很好的資源。在這裡，可以找到有關qPCR的所有知識，包括qPCR新的應用方法、定量算法、循環參數、試劑盒、染料等等。除此之外，許多商業和學術機構都在qPCR平臺上對他們的產品以及實驗方法做了非常詳細的概述。
6、針對酵母基因設計PCR引物
網址：
http://www.yeastgenome.org/
該網站對酵母的相關研究方法進行了優化，在Analyze這一欄中，點擊Design Primers即可針對酵母基因設計PCR引物。同樣點擊該欄目下的Restriction Mapper可簡單快速地分析酵母基因組的酶切位點，為後續構建基因表達載體打下基礎。另外，Webcutter也是一個常用於分析基因酶切位點的在線軟件。
7、從擴增曲線的斜率來估算PCR效率--LinRegPCR
網址：
https://dwz.cn/8HE6m4kD
在從荷蘭的學術醫療中心（AMC）免費下載適用於Windows操作系統的版本後，可從擴增曲線的斜率來估算PCR效率。該軟件這適用於使用SYBR標記或其他熒光探針的qPCR反應，並且能與所有qPCR儀器的數據兼容。對PCR效率進行可靠的估算可避免多次優化標準曲線，節省qPCR實驗操作的大量時間。
8、研究者們專屬的Facebook--ResearchGate
網址：
https://www.researchgate.net/
該網站有些像研究者們專屬的Facebook，方便研究者聯繫和跟蹤同事，上傳發表論文同時也可積極參與研究相關主題的討論。在該網站註冊登錄後，查看PCR板塊就可以詢問到與PCR相關的任何問題，最重要的是此網站中對問題的答覆都非常迅速，即便你是個完完全全的PCR新手，也能從中獲取很多有關PCR操作的建議和討論。
9、protocol集中營--Protocol Online
網址：
http://www.protocol-online.org/
這個網址類似於Research gate的Q&A部分，儘管該網站界面看起來有些簡單粗糙，但確是一個protocol集中營，可幫助實驗菜鳥解決疑難雜症。其中很多內容均是基於用戶體驗的，且囊括了很多有關實驗方面的問題及答案，因而解決問題時應擇善從之，符合或最接近自身實驗條件的才是最好的實驗protocol。
一招看懂RT-PCR 結果圖！
辛辛苦苦提完 RNA，逆轉錄後一個個孔加完引物和模板，最後進行 RT-PCR，你以為這樣就可以美滋滋地坐等結果了？等到一幅下面這樣的結果圖，不知道對於剛接觸 RT-PCR 的你來說內心是否是崩潰的？
這是啥？怎麼看？
別急，讓我慢慢跟你介紹，看完後你就能準確的分析出你的 RT-PCR 結果了。
「這裡以 7500 軟件為例進行介紹」
01
02 點擊進去後，選擇對應好的內參和對照組。「在 Relative Quantization Settings 選項下」
03選擇好內參和對照組後，我們首先看看 PCR 跑的有沒有問題，在這裡大家最常會見到的問題是在樣品池出現了三角形符號，如下圖：
那麼這些三角形代表什麼意思？
沒錯，聰明的你應該已經想到是這個孔出現了問題，而三角形中的數字是幾則代表了孔中有幾個問題。具體又是什麼問題呢？我們就要通過 analysis 中的 QC Summery 進行查找。
舉個栗子，比如圖中的 A9 孔，出現了 2，則表示有 2 個問題，第 1 個問題如上圖所示，High standard deviation 高的標準偏差，表示可能是你上樣時導致的樣品復孔之間差異較大。第二個問題則是下圖中，系統認定 A9 孔中的數值偏差較大，屬於異常值。
當然，還有比較常見的問題是引物二聚體引起的雙重峰，如 A4 孔。
04溶解曲線「melt curve」：表示隨溫度升高 DNA 的雙螺旋結構降解程度的曲線。總的 DNA 雙螺旋結構降解一半的溫度稱為熔解溫度「Tm」，不同序列的 DNA，Tm 值不同。DNA 中 G-C 含量越高，Tm 值越高，成正比關係。正如上面提到的，正常的樣品孔溶解曲線應該是單峰的.
如下圖：如果出現了雙峰，則要考慮是否引物設計不合理或者引物過量引起溶解曲線出現多峰的情況。
05如果前面的幾項都沒有太大的問題的話，最後我們看看最重要的結果，也就是目的基因的變化情況了。在內參與對照組選擇沒錯的情況下，點擊 gene expression 選項，選中你想查看的樣品孔的基因表達情況。
這次的 RT-PCR 看圖分析就到這裡。最後需要注意的是圖中的結果還需要輸出進行後續的自行運算得出結果，圖中的結果只能給出參考！
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