三種移植策略在反覆種植失敗患者凍融胚胎移植週期中的應用比較
金琪 駱麗華 黃玲莉 吳莉 王昊昱 童先宏 劉雨生
在試管嬰兒臨床工作中，我們發現反覆種植失敗的發生率達１０％～１５％。造成ＲＩＦ的原因中１／３是胚胎質量，２／３ 是子宮內膜容受性不良。基於此，從篩選優質胚胎、改善內膜容受性以及促進子宮內膜與胚胎間相互作用這三個方面入手，尋求與之對應的移植策略可能會給 ＲＩＦ患者帶來益處。囊胚移植可以挑選出更有發育潛能的胚胎，提高胚胎種植率及臨床妊娠率，因此廣泛應用於ＲＩＦ。越來越多的研究者將序貫移植和內膜機械性刺激應用於臨床，試圖從改善內膜容受性、促進胚胎髮育 及種植 來 提 高 ＲＩＦ 患 者妊娠成功率。 臨 床研究發現，與傳統的移植方法相比，序貫移植和內膜機 械刺激均可以明顯提高ＲＩＦ 患 者 成 功 率。但是這三種方法的優劣及臨床如何決策，目前尚缺乏文獻評價。本研究將臨床上常用的三種移植策略應用於ＲＩＦ 患 者 凍 融胚胎移植週期中，並對臨床結果進行比較，旨在為臨床選擇ＲＩＦ 的干預策略提供參考。
資料與方法
一、研究對象及分組
回顧分析２０１６年６月至２０１７年１２月在我院實施凍融胚胎移植的２２８例（２２８個週期）ＲＩＦ 患者的妊娠結局。
１．納入標準：
（１）ＲＩＦ診斷標準：４０歲以下女性在至少３個新鮮或冷凍週期中移植了４個以上優質胚胎後仍未實現臨床妊娠者視為 ＲＩＦ；
（２）本次移植前宮腔鏡及陰道 Ｂ 超檢查宮腔及子宮內膜符合以下條件：子宮內膜厚度＞７ｍｍ、無明顯子宮內膜炎症、宮腔內膜息肉或輕度宮腔粘連經過處理宮腔形態屬於正常；
（３）ＦＳＨ＜１０Ｕ／Ｌ，ＢＭＩ＜３０ｋｇ／ｍ２；
（４）有冷凍的第３天卵裂期和／或第５天囊胚期的胚胎，本次移植胚胎中至少有１枚優質胚胎。
２．排除標準：
（１）夫婦任何一方染色體異常；
（２）合併內科疾病如糖尿病、甲狀腺功能異常及自身免疫系統疾病；
（３）中、重度宮腔 粘 連及子宮 畸形；
（４）血液高凝狀態；
（５）子宮腺肌病；
（６）輸卵管積水未行輸卵管近端結紮或輸卵管切除；
（７）男方重度少弱精子症。
３．分組：
將患者分為研究組和對照組，研究組按照移植方案不同分為三組：
Ａ 組（序 貫 移植組）：移植１枚卵裂期胚胎＋１枚囊胚（４０例）；
Ｂ組（內膜機械性刺激組）：根據胚胎移植時間及數量的不同分為兩個亞組，
Ｂ１組：子宮內膜機械性刺激＋１枚囊胚移植（５２例）；
Ｂ２組：內膜機械性刺激＋２枚卵裂期胚胎移植（４７例）；
Ｃ 組（囊胚移植組）：移植１ 枚囊胚 （４０ 例 ）。
對 照 組 為 移 植 ２ 枚 卵 裂 期 胚 胎（４９例）。
二、研究方法
１．移植方案：
內膜機械刺激方案：移植當月月經第３～５天採用小號刮匙輕柔搔扒宮腔一週，內膜條件適宜時移植卵裂期胚胎或囊胚；
序貫移植方案：不進行內膜機械刺激，僅在同一個週期先移植卵裂期胚胎１枚，兩天 後再移植囊 胚 １ 枚；
囊胚移植方案：移植１枚囊胚。
２．凍融胚胎移植（ＦＥＴ）的內膜準備：
激素替代週期：月經第３天開始口服戊酸雌二醇（補佳樂，廣州先靈藥業）３ｍｇ ｂｉｄ，１０ｄ後 Ｂ超監測子宮內膜厚度，酌情調整藥物劑量。當子宮內膜厚度＞８ｍｍ 時加用黃體酮（黃體酮注射液，浙江仙琚）４０ｍｇ ｑｄ＋地屈孕酮（達芙通，雅培，荷蘭）１０ｍｇ ｂｉｄ轉化內膜。黃體酮轉化內膜第４天行卵裂期凍胚移植，第６天行囊胚移植。
促排卵週期：適用於激素替代週期子宮內膜生長不佳的患者。具體促排方案：月經第 ３天開始來曲唑（芙瑞，江蘇恆瑞醫藥）２．５～５ｍｇ／ｄ，或他莫昔芬（三苯氧胺，揚子江藥業）２０ｍｇ／ｄ，５ｄ後 Ｂ超監測內膜厚度及卵泡大小，酌情添加 ＨＭＧ３７．５～７５Ｕ／ｄ。當卵泡直徑＞１６ｍｍ，根據血 ＬＨ、Ｅ２和Ｐ水平適時予 ＨＣＧ ６ ０００～８ ０００Ｕ 誘導排卵，ＨＣＧ 誘導後第５天行解凍卵裂期胚胎移植，第７天行解凍囊胚移植。ＨＣＧ 誘導後第２天予以黃體酮（黃體酮注射液，浙江仙琚）４０ｍｇ ｑｄ＋地屈孕酮（達芙通，雅培，荷蘭）１０ｍｇ ｂｉｄ轉化內膜。
３．胚胎質量評估標準
（１）卵裂期胚胎評分標準：根據胚胎卵裂球大小、形態、數目、胞質及碎片將胚胎分為４級
Ⅰ級：胚胎卵裂球等大，形態規則，胞質均勻清晰，碎片無或＜１０％；
Ⅱ級：胚胎卵裂球大小不等，形態欠規則，碎片在１０．０％～２５．０％；
Ⅲ 級：胚胎卵裂球大小不均，碎片在２５．１％～５０．０％；
Ⅳ級：胚胎卵裂球大小不均，碎片＞５０．０％。
Ⅰ、Ⅱ級胚胎為優質胚胎。
（２）囊胚評分標準：根據 Ｇａｒｄｎｅｒ［６］提出的評價方法對第５天囊胚期胚胎根據囊胚腔的大小和是否孵化，將囊胚的發育分為６個時期。
１期：早期有腔室囊胚，囊胚腔小於胚胎總體積的１／２；
２期：囊胚腔體積大於或等於胚胎總體積的１／２；
３期：完全擴張囊胚，囊胚腔完全佔據了胚胎的總體積；
４ 期：擴張囊胚，囊胚腔完全充滿胚胎，胚胎總體積變大，透明帶變薄；
５期：正在孵出的囊胚，囊胚的一部分從透明帶中逸出；
６期：孵出的囊胚，囊胚全部從透明帶中逸出。
（３）處於３至６期的囊胚，還需對其內細胞團和滋養層細胞進行質量分級。
內細胞團分級：
Ａ 級，細胞數目多，排列緊密；
Ｂ 級，細 胞 數 目 少，排列鬆散；
Ｃ級，細胞數目很少。
滋養層細胞分級：
Ａ 級，上皮細胞層由較多的細胞組成，結構緻密；
Ｂ 級，上皮細胞層由不多的細胞組成，結構鬆散；
Ｃ 級，上皮細胞層由稀疏的細胞組成。
其中，評分在３ＢＢ以上為優質囊胚。
三、妊娠結局判斷及觀察指標
移植後１４ｄ檢測血清β－ＨＣＧ水平，β－ＨＣＧ陽性者於移植後３０ｄ行陰道 Ｂ超檢查，見孕囊者判定為臨床妊娠。
觀察指標：臨床妊娠率＝Ｂ超見孕囊例數／總例數×１００％，種 植 率 ＝ 孕 囊 總 數／總移植胚胎數 ×１００％，早 期 流 產 率 ＝ 流 產 例 數／見 孕 囊 例 數 ×１００％，多胎率＝多胎例數／見孕囊例數×１００％，異位妊娠率＝異位妊娠例數／見孕囊例數×１００％。
四、統計學分析
採用ＳＰＳＳ １９．０進行數據統計分析。計量資料用均數±標準差（珡Ｘ±ＳＤ）表示，兩組之間比較採用兩個獨立樣本ｔ檢驗，多組之間比較採用單因素方差分析；計數資料的比較採用χ２檢驗，Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法校正 Ｐ 值，Ｐ＜０．０５為差異有統計學意義。
結 果
一、患者一般資料比較
三組患者年齡、不孕年限、體重指數及基 礎ＦＳＨ 均無統計學差異（Ｐ＞０．０５）（表１）。
二、臨床結局比較
Ａ組臨床妊娠率、種植率顯著高於對照組（Ｐ 均＜０．０５）；Ｂ１ 組種植率顯著高於 對 照 組 （Ｐ＜０．０５）。多胎率、早期流產率、異位妊娠率各組間無統計學差異（Ｐ＞０．０５）（表２）。
討 論
試管嬰兒的成功與胚胎髮育潛能及子宮內膜容受性密切相關。子宮內膜容受性的建立，子宮內膜與胚胎之間相互作用並達到精確的同步化是胚胎成功植入的關鍵。子宮內膜容受性的建立主要受到雌、孕激素的調節。子宮內膜局部產生的多種促炎因子、抑 炎因子及信號分子，如前列腺素、生長因子、細胞因子、趨化因子、整合素、白血病抑制因子、雌激素和孕激素受體等也參與調節雌、孕激素的功能，使子宮內膜達到良好的容受狀態，為胚胎的生存、植入、分化提供一個適宜的微環境。 胚胎在植入時需要足夠的趨化因子和炎症細胞因子在母胎 界 面 調 節 胚 胎 的 侵 入 能 力，保 證 胚 胎 成功著床。另一方面，早期胚胎源性生長因子、細胞因子及信號分子可能對改善子宮內膜容受性、促進胚泡著床並維持妊娠有重要的作用。
Ｅｙｈｅｒｅｍｅｎｄｙ等發現早期胚胎可以誘使內膜進入“種植窗 ”狀態，可能與胚胎能分泌一些生長因子有 關，如 ＩＬ－１、轉 化 生 長 因 子、表 皮 生 長 因子、粒細胞巨噬細胞刺激因子等，在促進胚胎髮育的同時誘導子宮內膜容受性增加。Ｍｅｌｎｉｃｋ等比較了子宮內膜與胚胎共培養和單獨培養的胚胎卵裂率和囊胚形成率，發現共培養組胚胎的生長情況和囊胚形成率明顯優於單獨培養組。Ｂｉｎｄｅｒ等發現，在體外子宮內膜與胚胎共培養可以改善子宮內膜容受性，有利於胚胎生長及著床。以上研究結論說明子宮內膜與胚胎之間的作用是互利的。體外受精與自然受孕不同之處在於胚胎要在體外培養３～５ｄ，子宮內膜缺乏胚源性因子的刺激，內膜容受性可能受到影響，特別是對某些本身內膜容受性不良的患者影響更大。子宮內膜容受性低下也會影響胚胎髮育及胚胎與子宮內膜的同步化，從而降低胚胎成功植入的幾率。研究發現，有３０％不孕症患者存在子宮內膜種植窗改變，表現為種植窗提前、推後或縮短。臨床上部分患者 ＲＩＦ的原因可能是整倍體囊胚與植入窗口未同步化。
囊胚移植作為臨床上 ＲＩＦ 患者移植策略之一已達成廣泛共識，其與卵裂期胚胎相比有較大優勢。國內外研究發現：囊胚移植的臨床妊娠率和胚胎種植率明顯高於卵裂期胚胎移植［３］，早期流產率有降低的趨勢，單囊胚移植是降低多胎妊娠風險的有效方法。本研究發現，與卵裂期胚胎相比，單囊胚移植組臨床妊娠率、種植率均有升高的趨勢，而多胎率、早期流產率有降低的趨勢，但差異均沒有統計學意義（Ｐ＞０．０５）。
對於具有形態學 “正常”的 內 膜 及 胚 胎 的 ＲＩＦ患者除了胚胎因素外，更多的原因可能在於子宮內膜微環境的不良，因此從改善子宮內膜容受性方面尋找對策成為臨床治療反覆種植失敗的重 要突破點。臨床發現，內膜機械性刺激可改善 ＲＩＦ 患者的妊娠結局。子宮內膜機械刺激作用的機制有以下三方面：
（１）子宮內膜損傷可以促進子宮內膜幹細胞生長及子宮內膜螺旋動脈生成，增加子宮內膜血流，促進子宮內膜腺體的發育並使基質細胞水腫和蛻膜化從而增加胚胎 植 入的可能 性；
（２）內膜機械性刺激引發內膜炎症反應，可以提高子宮內膜局部促炎因子的表達，而早期胚胎種植在著床部位需要促炎因子的作用，使胚胎易於粘附在子宮內膜上，並促進滋養層細胞對子宮內膜的侵入；
（３）基因調控 方 面，有 研 究 發 現 在 ＲＩＦ 患 者 中 子 宮 內 膜ｍｉＲＮＡ表達異常，包括 ｍｉＲ－１４５，ｍｉＲ－２３ｂ和 ｍｉＲ－９９ａ的過度表達以及３種 ｍｉＲＮＡｓ的低表達。子宮內膜損傷可能調控子宮內膜基因的 ｍｉＲＮＡ 表達，從而利於胚胎植入。
子宮內膜機械刺激的主要優勢在於改善子宮內膜容受性，本研究中內膜機械刺激組的不足之處有：
（１）選擇囊胚移植，由於胚胎移植過晚，子宮內膜缺乏早期胚胎產生的胚源性生長因子、細胞因子及信號分子的調節作用，對某些內膜容受性不良的患者可能是無益的；囊胚體外培養存在培養失敗導致無胚胎移植的風險。
（２）選擇卵裂期胚胎移植，缺乏了通過囊胚移植來挑選胚胎的優勢。
近年來研 究 發 現：在ＲＩＦ患 者 新 鮮 移 植 周 期中，序貫移植組臨床妊娠率明顯高於卵裂期胚胎移植組；在 ＲＩＦ 患者凍融胚胎移植週期中，序貫移植組的臨床妊娠率和胚胎種植率均高於單純囊胚移植組；在非 ＲＩＦ 患者ＩＶＦ／ＩＣＳＩ新鮮週期中發現序貫移植組的胚胎種植率、臨床妊娠率及活產率均高於卵裂期胚胎移植組，而流產率低於卵裂期胚胎移植組。
序貫移植的優勢：
（１）第一次移入宮腔的胚胎產生的胚源性因子有助於創造最佳的內膜容受性狀態，促進胚胎的發育及種植，這是內膜機械性刺激無法完全替代的；
（２）囊胚移植的優勢是可以挑選更有發育潛能的胚胎，囊胚與子宮內膜同步性更好，有助於提高胚胎種植率。我 們的臨床研究初步顯示，序貫移植組（Ａ 組）與內膜機械刺激組（Ｂ１、Ｂ２）相比，臨床妊娠率有升高的趨勢，但差異沒有統計學意義（Ｐ＞０．０５）；
（３）序貫移植可以減少因囊胚培養失敗無胚胎移植的風險，增加 患 者週期妊娠機會。Ｙａｚｂｅｃｋ等［２３］研究顯示，４２％的患者在 Ｄ５／Ｄ６未獲得高質量囊胚，僅在 Ｄ２／Ｄ３行單卵裂期胚胎移植，妊娠率為２５．３％。本研究中擬序貫移植的患者中有１２例囊胚培養失敗，僅行 單卵裂期凍融胚胎移植，其臨床妊娠率為 １６．６７％（２／１２）。
序貫移植的不足之處：
（１）本研究結果顯示，序貫移植組較其他各組相比，多胎率有升高的趨勢，但差異無統計學意義（Ｐ＞０．０５）。Ｍａｃｈｔｉｎｇｅｒ等研究顯示，序 貫 移植多胎率達到５０％，與該研究移植胚胎數目過多有關（研 究 組 移 植 １～２ 枚 卵 裂 期 胚 胎 ＋１～２ 枚 囊胚）。我們的體會是實施序貫移植一定要嚴格控制移植胚胎的數目；對於子宮畸形或瘢痕子宮等特殊人群應慎重選擇序貫移植。
（２）序貫移植也存在囊胚培養失敗的風險，應慎重選擇。綜上所述，我們認為 ＲＩＦ 患者再次移植需要採取更加積極的策略，需要綜合每一種方法的作用機制及患者的具體情況進行決策。總體來說：選擇序貫移植、內膜機械性刺激＋囊胚移植及囊胚移植三種移植策略均有改善妊娠結局的趨勢，三者中序貫移植與傳統卵裂期胚胎移植相比，可顯著提高臨床妊娠率及種植率。另外，其可以降低因囊胚培養失敗無胚胎移植的風險，但同時可能增加多胎妊娠的風險。臨床應根據患者的具體情況及各種方法的利弊選擇個體化移植策略 ，如薄型內膜採用內膜機械性刺激可以改善患者的子宮內膜容受性從而有助於改善妊娠結局；對於 ＲＩＦ 中的特殊人群（如子宮畸形或瘢痕子宮、低反應、宮腔粘連分離術後患者等），由於序貫移植有可能增加多胎妊娠的風險，遂要慎重選擇，可以選擇有效性及安全性兩方面均有兼顧的內膜機械刺激法結合單囊胚移植方案。
【參考文獻】
(略）
