撰文 | 十一月
分離酶（Separase）是一種半胱氨酸蛋白酶，是所有真核細胞分裂末期過渡的觸發因子，具有類似caspase的催化結構域，但以前從未發現與細胞凋亡過程有關【1,2】。細胞分裂週期延長會引起細胞凋亡【3】；而細胞分裂週期縮短也會造成細胞異常，比如引起細胞非整倍性的發生，但是否會引起細胞凋亡的發生還很不清楚【4】。
兩篇Nature論文的第一作者，博士生Susanne Hellmuth. Graphic credit: Olaf Stemmann
2020年4月8日，德國拜羅伊特大學Olaf Stemmann研究組在Nature發表雙響炮文章，值的一提的是兩篇文章的第一作者均為Stemmann的博士研究生Susanne Hellmuth，兩篇文章分別題為Separase-triggered apoptosis enforces minimal length of mitosis以及Securin-independent regulation of separase by checkpoint-induced shugoshin-MAD2，揭開了有絲分裂期間分離酶separase在程序性細胞死亡過程中的功能以及其活性調控的新機制。
細胞凋亡內源調控過程是由促凋亡和抗凋亡的BCL2家族的蛋白進行平衡和調節的。BAK和BAX的同質多聚複合體的形成促進線粒體外膜孔道形成，導致線粒體外膜通透(Mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP)，並從膜間隙釋放細胞色素c和其他的一些凋亡因子，引發細胞凋亡。但是MOMP的現象可以被BCL2家族成員的存在消除，比如BCL2、BCL-XL（BCL2-like 1）和MCL1（Myeloid cell leukaemia 1）。separase通過切割黏連蛋白（Cohesin）kleisin亞基來打開黏連蛋白在DNA上形成的環，從而解開姐妹染色單體，促進染色體的正常分離
【2】（圖1）。細胞分裂過程的正常進行是人類生長和繁殖所必需的。
圖1 separase切割黏連蛋白環，促進姐妹染色單體分離Graphic credit: Olaf Stemmann
細胞分裂週期延長後，會造成細胞在有絲分裂期間死亡或者由於有絲分裂期間出現問題而在下一個細胞週期的間期內引起細胞死亡，但是有絲分裂週期縮短是否會引起細胞凋亡還不得而知 。為了對這個問題進行解析，Susanne Hellmuth通過實驗發現提前激活separase會造成細胞在有絲分裂期間死亡。這種由於separase活性提前釋放而引發的有絲分裂週期細胞凋亡的具體分子機制是怎樣的呢？作者猜測MCL1和BCL-XL可能是separase有絲分裂週期細胞凋亡的底物，作此猜測原因有三：1）細胞有絲分裂週期延長會引發凋亡【5,6】；2）MCL1和BCL-XL會被caspases切割；3）MCL1和BCL-XL包含能夠被separase切割的類似基序。通過體外生化實驗，作者的確證明MCL1和BCL-XL不僅可以被caspase3切割還可以被separase切割。而且，作者發現分離酶依賴的切割不僅會抑制MCL1的抗凋亡活性，而且還會通過切割產生兩個片段MCL1-N和MCL1-C，每個片段在進入有絲分裂時都會殺死細胞。MCL1-C之間可以形成相互作用，而且MCL1-C的促凋亡作用是細胞週期依賴的。進一步地，作者發現MCL1-C是通過形成有絲分裂特異性的MOMP現象引發的細胞死亡。因為MCL1和BCL-XL被切割後會釋放出BAK，而BAK和BAX會在線粒體外膜上形成環和大的孔洞結構，引起線粒體內容物外漏，促進程序性細胞死亡【7】。
作者進一步想要了解MCL1-C引起MOMP為什麼具有細胞週期特異性，因此將目光轉移到磷酸化過程上。作者通過位點篩選的確找到了MCL1-C中包含一個重要的磷酸化位點，通過磷酸化位點突變和模擬磷酸化的實驗確認正是由於在有絲分裂期間MCL1-C被特異性地磷酸化而引發了其促凋亡活性的產生。
在正常情況下的細胞，MCL1和BCL-XL在有絲分裂後期一開始就出現了，但是separase激活的時候卻沒有引起直接細胞死亡，那麼一定存在一個在有絲分裂期間發揮作用的因子能夠調控separase的功能。考慮到前人的研究曾經發現separase切割黏連蛋白亞基需要被磷酸化【8】，作者在體外檢測了一下各種各樣的激酶是否參與到了MCL1和BCL-XL的切割過程。作者發現激酶NEK2A對於separase切割MCL1和BCL-XL都是非常關鍵的。這也解釋了在有絲分裂後期separase不會引發細胞有絲分裂期死亡是因為NEK2A和其他的一些激酶的在後期已經降解，而MCL1和BCL-XL由於去磷酸化作用也不再是separase的底物（圖2）。可以想見的是，如果NEK2A和separase的活性階段出現任何重疊的話就會造成細胞有絲分裂週期死亡。
圖2 正常情況下NEK2A和separase酶活性區間存在細胞週期時間差異
SAC（Spindle assembly checkpoint）複合體在M期活躍，也正是因為這樣決定了SAC複合體活性持續的時間【9】。SAC活性的缺失會造成細胞有絲分裂期加快，引發染色體不穩定【4】。作者想，在此情況下，separase是否因為NEK2A沒有被完全降解就已經被激活，導致了細胞有絲分裂期死亡。通過基因敲除和體外生化實驗的驗證，作者發現SAC複合物活性的缺失足以誘導separase引起MCL1和BCL-XL被切割從而引發細胞有絲分裂期死亡。
因此，作者發現NEK2A和separase形成了一個有絲分裂期間的監控檢驗點，通過消除由於早期有絲分裂的加速進展而容易導致染色體錯分的細胞，減少SAC失活細胞一定會產生染色體不穩定性和非整倍性的可能，確保具有正確M期的細胞存活從而保護機體免受癌變的威脅。作者將此分子機制稱為"minimal duration of early mitosis checkpoint"（有絲分裂最短時間檢驗點）。
另一方面，Susanne Hellmuth與西班牙的研究組進行合作，發表了關於分離酶活性調節的研究。真核生物姐妹染色單體的分離是由SAC複合體計時進行的，最終觸發分離酶切割黏連蛋白環，確保姐妹染色單體分離的正常進行，SAC複合體對於遺傳過程具有控制權。而在細胞中期SAC複合體沉默將激活泛素連接酶APC/C（Anaphase-promoting complex） 複合體，造成separase抑制因子securin蛋白被送到蛋白酶體降解【10】。但是securin缺失，哺乳動物細胞中的姐妹染色單體仍然能夠正常分離，但是在此情況下separase的活性是如何被調節和控制的還不得而知。作者們發現，減數分裂黏連蛋白保護因子SGO2（shugoshin 2）會取代securin的功能與MAD2相互作用變成separase新的抑制複合體SGO2-MAD2。SGO2和securin採取類似的策略【2】，作為separase的一個假底物競爭性的抑制separase的活性。APC/C依賴的泛素化作用和AAA-ATPase TRIP13的活性會與MAD2的特異性適配因子p31comet協同發揮作用將separase從SGO2-MAD2複合體中釋放出來。也就是說，SGO2和securin都能防止分離酶在錯誤的時間啟動染色質分離的過程，如果securin失效，SGO2也能調節細胞中separase的活性，為細胞分裂過程的正常維持提供了"雙保險"機制。
圖3 分離酶雙保險調節模式示意圖
總的來說，Olaf Stemmann研究組的這兩篇工作進一步拓展了人們對於分離酶功能的認識，同時也為細胞有絲分裂過程中姐妹染色單體的正常分離的調節機制提供了新穎的觀點。另外，Olaf Stemmann教授表示在文章投稿發表過程中其中一個審稿人對文章發表了極高的評價，認為該研究將會改寫教科書（I was particularly pleased to hear a remark on our publication by one referee that the textbooks will now have to be rewritten），而Olaf Stemmann研究組也在進行進一步地研究，希望能將該發現應用於癌症治療方面。
原文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41586-020-2187-y
https://doi.org/10.1038/s41586-020-2182-3
製版人：小嫻子
參考文獻
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