一、引 言
基因治療作為一種潛在的治療遺傳病的方法，如嚴重的聯合免疫缺陷、囊性纖維化、帕金森病以及傳統化療治療癌症的替代方法，在過去20年裡受到了極大的關注[1]。它是通過將遺傳物質轉移到特定細胞中調節基因表達進而治療疾病的一種方法。典型的遺傳物質包括外源性核酸，如DNA、信使RNA (mRNA)、小干擾RNA (siRNA)和microRNA (miRNA)。成功的基因治療需要識別治療基因，並將該基因高效地轉移到目標細胞中。最初的研究集中於使用病毒載體，包括逆轉錄病毒和腺病毒，因為這些載體在將DNA和RNA傳遞給眾多細胞系方面表現出了高效率。然而,與病毒載體系統相關的基本問題，包括毒性、免疫原性，以及放大過程的侷限性，促進了對其他潛在的支架外源性DNA進入目標組織的研究[2]。
非病毒載體系統，包括陽離子脂質體、聚合物、樹突狀分子和肽，都提供了將DNA壓縮以供系統傳遞的潛在途徑。然而，與進化出克服細胞屏障和免疫防禦機制的病毒類似物不同，非病毒基因載體由於受到大量細胞內外屏障的阻礙，其轉染效率持續顯著降低[3]。但是，這些化合物有著很好的生物相容性，並且可以大規模生產，有望將其應用於基因治療。
因此，在過去十年裡，大量的科研人員都在設計陽離子化合物，多肽是其中的代表，能與DNA形成複合物，並且可以克服基因傳遞的體內和體外屏障，有著很好的效果。本文將從體外細胞攝取和體內轉染的問題出發，舉例介紹基因遞送中陽離子多肽的各種性質，最後對合成陽離子多肽用於基因治療存在的問題和未來的發展方向提出了展望。
二、基因治療的體內外屏障
（一）體外細胞攝取障礙
有研究結果表明，形成複合物的大小取決於所使用的陽離子結構的類型(儘管製備條件中DNA濃度、pH值、緩衝液類型和N/P比也會影響大小)。例如，陽離子低聚物，如半胱氨酸-精氨酸-半胱氨酸表現出可逆結合，導致單個DNA分子的崩潰[4]。因此，根據複合物的理化特性來預測基因的體外和體內轉染效率仍然是不可能的。
對於非靶向陽離子複合物，有證據表明複合物首先通過與陰離子細胞表面蛋白聚糖的靜電相互作用與細胞膜結合,再通過各種內吞途徑進行細胞攝取。複合體的大小會影響不同細胞的吸收，與聚合物的分子量有關。高分子量聚賴氨酸(224 kDa)形成直徑在100-300 nm的DNA複合物，低分子量聚賴氨酸(4 kDa)形成直徑在20-30 nm的複合物[5]。
細胞溶膠對到達細胞核的DNA/載體複合物有多重屏障。腺病毒、血清型和單純皰疹病毒等病毒通過微管介導的轉運通過細胞質，而陽離子載體介導的基因傳遞通常缺乏這種輔助轉運，把DNA壓縮成小顆粒的載體應該有助於DNA向細胞核的運動[6]。
（二）體內轉染障礙
雖然陽離子DNA載體系統通常在體外表現出成功的基因遞送效果，但在生理條件下會受到複雜的不穩定性的阻礙。生理鹽濃度(150mm)經常促進陽離子複合物的聚集，導致血管堵塞。此外，陽離子複合物容易與血清蛋白(如血清白蛋白)結合，阻礙細胞攝取，促進細胞聚集，並可能促進吞噬作用[7]。這些結果表明，通過減少鹽/血清的影響可以促進體內基因轉染，實驗中最常用親水分子（例如PEG）修飾複合物的外圍來減少這些影響[8]。
三、基因治療的載體——陽離子多肽
NCAs開環聚合合成多肽是一類重要的生物材料。這些合成多肽的特性，包括其側鏈的化學多樣性和形成二級結構的能力，使其在基因遞送、藥物遞送、生物成像、組織工程和抗菌等領域具有廣泛的應用前景[9]。螺旋多肽、陽離子多肽作為非病毒基因傳遞載體是由細胞穿透多肽(CPPs)的膜活性激發的，CPPs可促進其他載體的細胞內化和內體逃逸，提高轉染效率。在CPPs的膜傳導過程中，CPPs常形成螺旋結構，螺旋結構與CPPs的膜透入能力密切相關。然而，CPPs的長度往往過短，且缺乏足夠的陽離子電荷，這限制了其作為單一傳輸載體的應用[10]。因此，螺旋多肽載體的設計可以潛在地結合PLL(核酸作為獨立載體的縮合)和CPPs(膜活性)的優點。具有代表性的基因遞送a螺旋、陽離子多肽的化學結構如下圖所示[11]。
（1） 螺旋相關的細胞穿膜能力
基於a-螺旋型離子多肽的開發，程課題組報道了一種合成方法，獲得了含有不同側鏈氨基的陽離子多肽文庫。這些多肽在較大pH範圍內呈現穩定的a螺旋構象，但側鏈疏水/親水平衡和電荷密度不同。聚(g-(4-(2-(哌啶-1-酰基)乙基)氨基甲基)苄基)-穀氨酸)(PPABLG，又稱PVBLG-8)被認為是文庫中最有效的多肽；在轉染效率方面，比市面上可用的轉染劑聚乙烯亞胺(PEI, 25 kDa)高出12倍[12]。相比之下，其外消旋模擬物PPABDLG(或PVBDLG-8)採用隨機線圈構象，轉染效率卻可以忽略不計。a-螺旋構象使多肽具有核殼結構，多肽骨架核周圍有側鏈，側鏈末端帶有陽離子基團。側鏈的移動性和靈活性對多肽的膜活性至關重要，隨機捲曲多肽不能形成明確的螺旋結構，因而膜活性較低[13]。
（2） a-螺旋多肽的結構優化
疏水和親水含量的平衡對細胞穿透聚合物的膜活性有重要影響。程課題組基於不同疏水側鏈的聚(g-(3-(4-(胍丁氨甲基)-1h-1,2,3-三唑-1-酰基)丙基)穀氨酸(PGTLG)，開發了一類螺旋狀聚(精氨酸)仿生品(HPRMs)[14]。與其他缺乏有序二級結構(如寡氨基甲酸酯、肽)的富含胍類CPP仿生物相比，HPRMs在陽離子聚合物設計中既具有螺旋性又具有疏水性，在分子水平上闡明瞭結構性能關係。結果表明,側鏈長度增長或疏水烷基鏈整合在一個適當的分數(10 mol%)能顯著提高膜透性。在細胞滲透能力方面，表現最好的HPRM, P14，比Arg9和TAT等商業CPPs的細胞滲透能力高出12個數量級。此外，還研究了電荷類型對細胞穿透能力的影響。與氨基側鏈多肽相比，胍基多肽具有優越的膜活性，可能是通過附加的雙齒氫鍵與DNA分子的磷酸陰離子結合更強。
{3） 其他官能團的引入
隨著PPABLG作為非病毒載體的發展，程課題組將各種功能納入該系統，旨在實現安全高效的基因遞送。例如，將PPABLG與含有氨基葡萄糖側鏈的多肽聚(g-(4-(氨基葡萄糖甲基)苄基)-l-穀氨酸))結合，形成了一個三元複合體系，在不影響膜活性的情況下顯著提高了生物相容性。該課題組還設計了一系列具有不同分子結構(二嵌段、三嵌段、接枝、星形)的PEG-PPABLG共聚物，並對其結構相關的膜活性進行了研究。星形共聚物的膜活性最高，基因轉染效率最高，這可能與多價多肽膜相互作用有關[15]。
為了降低陽離子多肽的毒性並促進轉染後DNA的釋放，程課題組製備了由PPABLG和聚(g-(4,5-二甲氧基-2-硝基苄基)-l-穀氨酸(PDMNBLG)組成的隨機共聚物多肽，具有光響應側鏈解離行為。與PPABLG單肽相比，隨機共聚物具有相似的膜活性，而PDMNBLG殘基具有相似的膜活性[16]。紫外線照射後轉化為陰離子PLG單元，導致a-螺旋構象破壞，電荷密度降低。因此，在轉染後的UV處理促進了細胞內DNA的釋放，消除了長期的物質毒性。
到目前為止，多肽生物醫用高分子材料與蛋白質的結構和功能還遠遠不能匹配，部分原因是合成多肽與蛋白質相比缺乏序列控制和單分散性，而單分散性是精確構建高級有序結構的關鍵[17]。因此，在設計、調控和應用合成多肽二級結構方面的最新進展令人鼓舞，這是朝著模擬蛋白質結構和功能邁出的一大步，而進一步瞭解高序結構與多肽功能之間的關係，將是多肽科學家未來努力的重要方向[18]。同時，NCA單體的合成、純化和處理過程成本高、繁瑣，對NCA純度高、無水聚合條件等可控多肽合成要求嚴格，這些是合成多肽的關鍵障礙。另外，如何提高多肽的抗溼性和簡化NCA和多肽化學的過程，對多肽化學家而言也是極具挑戰性的任務。
四、結 語
合成陽離子多肽作為一類具有良好生物相容性、生物降解性、化學多樣性和形成二級有序結構的基因遞送材料，被廣泛認為是生物醫學應用中最重要的生物模擬聚合物之一。本文針對基因治療中體外細胞攝取和體內轉染時存在的問題，舉例介紹了基因遞送中陽離子多肽的各種性質，最後對合成陽離子多肽用於基因治療存在的問題和未來的發展方向提出了展望。在生物醫用高分子領域，陽離子多肽為基因治療提供了廣闊的空間，那麼未來如何應用於臨床，我們一起期待。
參考文獻
[1]Mintzer M A , Simanek E E . Nonviral Vectors for Gene Delivery[J]. CHEMICAL REVIEWS, 2009, 109(2):259-302.
[2] Anderson W F. Human gene therapy.[J]. Nature, 1992, 256(5058):25-30.
[3] Verma I M, Somia N. Gene therapy -- promises, problems and prospects[J]. Nature, 1997, 389(6648):239-42.
[4] Blessing T, Jeanserge Remy A, Behr J P. Template Oligomerization of DNA-Bound Cations Produces Calibrated Nanometric Particles[J]. Journal of the American Chemical Society, 1998, 120(33):8519-8520.
[5] Dash P, Read M L, Wolfert M, et al. Factors affecting blood clearance and in vivo distribution of polyelectrolyte complexes for gene delivery[J]. Gene Therapy, 1999, 6(4):643-650.
[6] Sodeik B, Ebersold M W, Helenius A. Microtubule-mediated transport of incoming herpes simplex virus 1 capsids to the nucleus.[J]. Journal of Cell Biology, 1997, 136(5):1007-1021.
[7] Dash P, Read M L, Wolfert M, et al. Factors affecting blood clearance and in vivo distribution of polyelectrolyte complexes for gene delivery[J]. Gene Therapy, 1999, 6(4):643-650.
[8] Yen J , Zhang Y , Gabrielson N P , et al. Cationic, helical polypeptide-based gene delivery for IMR-90 fibroblasts and human embryonic stem cells[J]. Biomaterials Science, 2013, 1(7):719.
[9]-[11] Song Z, Han Z, Lv S, et al. Synthetic polypeptides: from polymer design to supramolecular assembly and biomedical application[J]. Chemical Society Reviews, 2017, 46(21):6570.
[12] Gabrielson N P , Lu H , Yin L , et al. Reactive and Bioactive Cationic α-Helical Polypeptide Template for Nonviral Gene Delivery[J]. 2012, 51(5):1143-1147.
[13] He H , Zheng N , Song Z , et al. Suppression of Hepatic Inflammation\r, via\r, Systemic siRNA Delivery by Membrane-Disruptive and Endosomolytic Helical Polypeptide Hybrid Nanoparticles[J]. ACS Nano, 2016:acsnano.5b05470.
[14] Tang H , Yin L , Kim K H , et al. Helical poly(arginine) mimics with superior cell-penetrating and molecular transporting properties[J]. Chemical Science, 2013, 4(10):3839-3844.
[15] Yin L , Song Z , Kim K H , et al. Reconfiguring the architectures of cationic helical polypeptides to control non-viral gene delivery[J]. Biomaterials, 2013, 34(9):2340-2349.
[16] Yin L , Tang H , Kim K H , et al. Light-Responsive Helical Polypeptides Capable of Reducing Toxicity and Unpacking DNA: Toward Nonviral Gene Delivery[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2013, 52(35):9182-9186.
[17][18] Song Z, Han Z, Lv S, et al. Synthetic polypeptides: from polymer design to supramolecular assembly and biomedical application[J]. Chemical Society Reviews, 2017, 46(21):6570.
