撰文 | 亨利
新冠肺炎疫情发生以来，全球科学家们和医生们都在寻找药物，以减少感染人数，结构生物学家们也在此次疫情中进行了广泛的科学研究，从最早饶子和院士课题组公布Mpro蛋白结构推动药物筛选（中科院上海药物所/上科大联合研究团队发现一批可能对新型肺炎有治疗作用的老药和中药），到ACE2-RBD的解析（Nature背靠背｜王新泉/张林琦、李放分别发表新冠病毒与人ACE2受体复合物结构），科学家们为推动药物研究提供了重要的结构依据。
而在新冠病毒的所有蛋白中，Mpro和RdRp被认为是两个最重要的病毒靶点，在病毒的生命周期中，有一个重要的过程就是复制，新冠病毒的复制复合物主要由病毒的非结构蛋白（nsp）的多亚基转录复合物组成，核心成分主要是RNA依赖的RNA聚合酶催化亚基（nsp12），而nsp12的功能发挥也需要nsp7和nsp8两个辅因子参与，它们的加入将促进nsp12与RNA模版的结合，同时也成为了核苷酸类似物例如瑞德西韦（Remdesivir）的作用靶标。
Rdrp活性实验以及瑞德西韦抑制试验
2020年5月1日，中国科学院上海药物研究所徐华强研究员、浙江大学张岩教授、北京协和医院张抒扬教授和上海药物研究所许叶春研究员等合作在Science杂志上发表文章Structural Basis for the Inhibition of the RNA-Dependent RNA Polymerase from SARS-CoV-2 by Remdesivir，解析新冠病毒复制酶与瑞德西韦复合物结构（该文章曾于4月9日发表在预印版平台bioRxiv上）。
为了阐释新冠病毒与RNA的相互作用，以及瑞德西韦的药物作用机制，研究者们首先通过昆虫细胞共表达了新冠病毒的复制酶三元复合物，通过EMSA实验验证了复合物与RNA的结合，紧接着经验丰富的药物化学家沈敬山等指出三磷酸形式的瑞德西韦（Remdesivir-TP）才有可能抑制RdRp，并合成了Remdesivir-TP用于结构测定，同时，作者们首次利用了体外生化实验，建立了新冠病毒复制酶活性的测定方法，并且通过Remdesivir-TP和Remdesivir设计和建立了药物抑制试验，揭示了Remdesivir-TP才是最终发挥活性的小分子形式。
本研究在饶子和院士课题组前期的RdRp研究（详见此前BioArt的报道：饶子和团队解析新冠病毒RNA依赖RNA聚合酶（瑞德西韦靶点）高分辨率结构，该工作已于2020年4月10正式在Science杂志在线发表）的基础上，进一步通过冷冻电镜获得了2.8埃分辨率的apo复合物结构和2.5埃分辨率的复制酶/RNA/瑞德西韦复合物，两个结构总体上十分接近，研究者们在模板引物RNA和nsp12之间观察到广泛的蛋白质-RNA相互作用，其中nsp12共有29个残基直接参与RNA的结合，出乎意料的是，尽管RdRp的RNA结合需要这两种蛋白质，但nsp7或nsp8并未介导RNA相互作用。
RdRp的催化活性位点七个保守基序构成，同时研究者们也观察到了拇指亚域中D618和S814参与了催化中心两个镁离子的配位。
nsp12复合物apo结构
复制酶/RNA模版/瑞德西韦复合物结构
结构比较发现，apo蛋白结构和后者结构之间的一些差异。第一个差异在于nsp7的位置似乎朝nsp核心移动了1.0到1.7Å，导致与第二个nsp8的连接重排；在连接拇指亚结构域的第一个和第二个螺旋的环中观察到第二个差异，该环向外移动了4.7Å，以适应双链RNA螺旋的结合，同时，基序G残基K500和S501也向外移动2.0埃，同样发挥适应模版结合的作用。
除了瑞德西韦，其它几个核苷酸类似物如Favipiravir（法匹拉韦）, Ribavirin（利巴韦林）,Galidesivir（BCV4430）和EIDD-2801也有相似的作用机理，可以有效地抑制细胞内SARS-CoV-2的复制。因此研究者们也通过结构解析揭示了这些药物是如何抑制SARS-CoV-2 RdPp的活性。有趣的是，EIDD-2801抑制病毒复制的效果是瑞德西韦的3-10倍。
在新冠病毒的众多蛋白中，RdRp被认为是许多现有核苷酸类似物的主要靶标。在这篇文章中，研究者们报告的结构揭示了模板引物RNA如何被酶识别以及瑞德西韦对链延长的抑制作用。结构比较和序列比对表明，底物RNA识别和瑞德西韦抑制RdRp的模式在多种RNA病毒的RdRp中高度保守，总之，这些发现为设计更有效的抑制剂对抗新冠肺炎的感染提供了理论依据，也为基于核苷酸类似物设计广谱抗病毒药物提供了基础。
据悉，该研究由中国科学院上海药物研究所徐华强研究员、浙江大学张岩教授、北京协和医院张抒扬教授和上海药物研究所许叶春研究员等共同完成，中科院上海药物所蒋华良和沈敬山课题组在瑞德西韦三磷酸活性成分合成方面给予大力支持。中国科学院上海药物研究所徐华强课题组博士后
尹万超为论文第一作者，浙江大学博士后毛春友、清华大学医学院博士生栾晓东，浙江大学研究助理沈丹丹和博士后沈庆亚，以及上海药物研究所博士生苏海霞为论文的共同第一作者值得一提的是，4月9日，上海科技大学饶子和/杨海涛团队联合中科院上海药物所蒋华良团队以及清华大学、军事医学科学院、中科院武汉病毒所等单位的研究人员合作在Nature杂志在线发表了题为“Structure of Mpro from COVID-19 virus and discovery of its inhibitors”的论文，解析了新冠病毒水解酶Mpro的结构并基于该结构进行了药物筛选并利用了细胞实验评估了药物效果，发现了具有较强病毒抑制作用的小分子（Mpro（水解酶）和Rdrp（RNA依赖RNA聚合酶）被认为是新冠病毒的两大重要靶点，详见BioArt报道：饶子和/杨海涛/蒋华良合作团队解析新冠病毒水解酶结构并筛选出多种具有病毒抑制作用的小分子）。
原文链接：
https://science.sciencemag.org/content/early/2020/04/30/science.abc1560
關鍵字: RdRp 病毒 Remdesivir
