前言
單細胞測序技術已經成為科研人員強有力的研究工具。目前能夠進行單細胞測序分析的實驗方法類型眾多。有基於液滴分離的方法，有基於流式細胞術分選的方法。這些方法的數據質量如何，它們各自有什麼優缺點，本文進行了系統性的比較。歐易生物基於自身長期的單細胞測序實驗工作，為您帶來詳盡解讀。
基本信息
文章題目：Systematic comparative analysis of single cell RNA-sequencing methods
期刊：Nature Biotechnology
研究背景
單細胞測序技術目前處於快速發展當中，各種新技術、新方法不斷被開發出來用於解決特定的生物學問題。這些方法基於不同的原理和方案，產生的結果不盡相同，對它們進行全面的相互對比，並在此基礎上確定單細胞測序技術的相關質量標準，以便幫助科研工作者選擇適合自己實驗的技術方法，這種系統性的比較工作是目前的當務之急。過去的一些比較工作主要的缺陷在於不繫統和不全，例如許多工作僅僅比較特定細胞系，而忽視了組織樣本。
研究內容
作者選擇了7種單細胞測序技術，對三種不同類型的樣本進行了系統性的比較。7個平臺中包括2種低通量技術（圖1）：Smart-seq2以及CEL-Seq2；另外還有5種高通量技術，分別是：10x Chromium, Drop-seq, Seq-Well, inDrops及sci-RNA-seq。三種類型的樣本分別是（圖2）：人類細胞系HEK293及小鼠細胞系NIH3T3等比例混合樣品；冷凍保存的人類外周血單核細胞（PBMCs: peripheral blood mononuclear cells）；以及小鼠腦部皮質組織細胞核。
圖1 | 本文的單細胞測序技術平臺囊括了2種低通量技術和5種高通量技術。
圖2 | 採用三種類型的樣本進行分析。
作者通過對六種主要指標進行了系統性的分析和比較，包括靈敏度（sensitivity）、重複性（reproducibility）、精密度（technical precision）、鑑定到的細胞類型（capturing biological information about cell types）、操作時間及成本。
研究結果
1. 相對於高通量方法，Smart-seq2以及CEL-seq2擁有更高的靈敏度（圖3-5）。其餘幾種高通量方法的靈敏度沒有明顯差別。
圖3 | 混合細胞系中，各種方法靈敏度比較。
圖4 | PBMC樣品中，各種方法靈敏度比較。
圖5 | 小鼠腦皮質組織細胞核樣品中，各種方法靈敏度比較。
2. 在檢測的7種方法中，10x Chromium的表現最為穩定（strongest consistent performance），顯示出極高的重複性（圖6）。
圖6 | 人類細胞系樣品中，各種方法重現性比較。
3. 除Smart-seq2之外，其餘6種方法的精密度均表現良好，其CV值均在0.5%以內（圖7）。
圖7 | 人類細胞系樣品中，各種方法精密度比較。
4. sci-RNA-seq在檢測中不能總是鑑定到全部的細胞類型，顯示出該方法仍然需要進行改進。其餘技術鑑定到的細胞類型結果較為一致（圖8）。
圖8 | 小鼠腦皮質組織細胞核樣品中，各種方法鑑定到的細胞類型的比較。
5. Drop-seq, inDrops及Seq-Well三種技術成本最低，Smart-seq2成本最高，其餘方法成本相當。但是考慮到單個細胞的成本，則是sci-RNA-seq成本最低，因為它可以實現百萬級別的細胞通量。
6. 操作時間上，10x Chromium得到數據所需的時間較少，而Smart-seq2, CEL-Seq2及inDrops則耗費較長，其餘方法花費的時間相當。
7. Smart-seq2儘管成本較高、通量較低同時較為費時，但是它在檢測結構變異以及RNA剪切變異中具有較大優勢，因為它能夠測序得到基因全長，而不僅是3’端序列。
8. 相比使用單個完整細胞，使用細胞核進行單細胞測序具有幾點優勢：1）能夠應用於冷凍保存的樣品；2）能夠應用於難以進行解離獲得單細胞懸液的組織；3）避免解離過程對細胞轉錄譜的人為影響，造成結果偏差。
寫在最後
細胞是生命活動的基本功能單位。生命系統的本質是不同類型細胞之間的相互作用網絡。單細胞測序技術是對這一網絡進行解析的最強有力的手段。目前單細胞測序技術仍然處於不斷更新與開發之中，選擇哪一種方法作為研究技術，是關係到實驗成敗的關鍵因素。本文為我們的選擇提供了詳實的數據，幫助我們根據自己的研究對象做出正確的選擇。同時，文章中的數據與驗證思路也是我們今後進行方法開發和升級的重要基礎和起點，具有極大的參考價值和意義。
歐易生物目前已經成功開展數百例單細胞測序實驗，依據我們的經驗，進行方法選擇時可考慮以下原則：
1. 綜合考慮成本、實驗結果的穩定性等因素，應當優先選用10x Chromium，因為它是目前結果最為穩定的平臺，且已經實現了穩定的商業化，對於不熟悉相關分子生物學操作（如測序建庫）的實驗室，可以大大縮短整體實驗週期並獲得高質量的數據。
2. 如果對細胞的通量有非常大的需要，應當優先選擇sci-RNA-seq，因為它能夠實現百萬級別的單細胞測序，而其它技術單次實驗中僅能分析數萬細胞。
3. 如果僅有數百細胞需要進行單細胞測序，且對數據的靈敏度有較高要求時，應當優先選擇Smart-seq2技術。比如需要對發育中的胚胎細胞進行單細胞測序。
歐易生物單細胞測序服務
歐易生物是國內較早開展單細胞測序分析的公司之一。目前擁有10X Genomics及BD Rhapsody™兩個單細胞測序平臺，以及完整、系統的生物信息學分析技術和流程，竭誠為廣大用戶提供高質量的單細胞測序服務。
公司成立十餘年來，本著為客戶提供優質且有溫度的高端技術服務這一核心理念，不斷開拓進取，通過技術研發、流程優化、精良設備引進、優秀人才聚集、持續管理提升，建立起了行業一流的質量標準以及嚴格的質量管控體系，並始終秉承“硬數據，好服務”的一貫追求，為客戶提供優質的高端技術服務。
歡迎有意向開展單細胞測序研究的老師們向我們諮詢溝通單細胞相關問題
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本文系歐易生物原創
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