进化上保守的p53蛋白及其细胞通路通过对环境扰动的感知、调节和整合反应介导肿瘤抑制，从而导致细胞死亡或维持细胞稳态。
TP53基因家族在多细胞动物发育过程中已经进化了6亿至8亿年。自从发现该基因家族以来，已经花了40年来了解为什么TP53基因是人类癌症中最常见的突变基因。显然我们还有很多东西要理解，但也已经知道了不少。2020年5月13日，美国科学院院士、普林斯顿高等研究院系统生物学中心荣誉教授——Arnold J. Levine在《Nature Reviews Cancer》发表题为“p53: 进化了8亿年的基因——40年的发现 - 知乎p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery"的文章，系统介绍了p53基因。主要包括三个方面：首先，TP53基因家族的进化及其成员在无脊椎动物和脊椎动物中的功能。其次，TP53突变在多种癌症中的作用——TP53突变在哪些组织类型的干细胞或祖细胞中起作用或不起作用，在这些不同的组织类型中TP53突变的顺序。最后，细胞中p53途径的功能结构和几何结构如何影响其功能、p53途径收集和整合的信息以及该途径如何响应。这些信息汇总到一起，有助于我们理解为什么编码p53的基因的突变是人类癌症中最常见的单一特征。
p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery
MDM2，是一种E3泛素连接酶，通过蛋白质修饰增加或降低其对p53蛋白的亲和力，或改变其对p53蛋白底物的连接酶活性来应对各种内在和外在的细胞应激。通过应激信号抑制MDM2的活性会延长p53蛋白的半衰期，并迅速激活其转录功能。然后p53转录一组基因，从而介导修复这些压力引起的损伤或诱导细胞凋亡。MDM2和p53形成复合物，激活并调控p53通路，该中枢将MDM2与压力信号连接在一起（图1和2），从而导致MDM2与p53的结合较弱且无法泛素化（图1），使得p53稳定或较高的连接酶活性与p53结合，导致蛋白酶体中的p53降解。 因此，MDM2-p53中枢起始于与许多应激信号、MDM2和p53蛋白以及蛋白酶体降解机制之间的广泛交流。一旦p53稳定并激活，它就通过转录与一系列广泛的细胞信号转导通路相互作用（图3），包括细胞死亡或应激诱导的细胞损伤修复等许多不同的细胞功能。
图1. 应激信号导致p53激活
图2. 应激信号导致p53抑制
图3. p53对不同类型应激反应的转录输出
十多种不同的应激信号介导了p53细胞浓度的增加及其转录激活（图1）。其他的细胞应激导致p53活性降低（图2）。
p53家族
人类的p53样转录因子由TP53、TP63和TP73这三个基因编码。p53、p63和p73的蛋白质结构相似，三个DNA结合结构域在结构上几乎相同，与相似的DNA特异性序列结合，并调节一些相同基因和不同基因的转录。C-末端结构域在大小、序列和功能上互不相同，并调节DNA的结合和转录、介导蛋白质内和蛋白质间的功能性相互作用。这三种蛋白质的N端序列都编码至少两个不同的转录激活域。
与p53相似，p63通常通过诱导细胞死亡来对DNA损伤做出反应，但在雌性和雄性生殖细胞系中。p63也是在整个人体鳞状细胞上皮产生和再生中的关键转录因子，并参与颅面结构、四肢和中枢神经系统。p73是产生纤毛上皮细胞所必需的，因此在包含这些细胞的许多组织中起作用（雄性生殖系、免疫系统、听力、气管、肺、中枢神经系统等）。
在小鼠和人中，许多不同的组织特异性干细胞会持续存在并在整个生命中自我复制。例如，小鼠结肠干细胞可以响应组织特异性生长因子（例如WNT）在培养基中复制和扩增，从而形成类器官并产生在这些组织或器官中发现的许多细胞类型。在小鼠和人中，组织特异性干细胞通过正常的细胞更新不断地替代衰老的组织。哺乳动物每天会产生数十亿个新细胞。例如，结肠每4天会翻新，皮肤每28天更新一次，并且不断产生血细胞。这很可能是人和某些其他哺乳动物的寿命比p53: 进化了8亿年的基因——40年的发现质量寿命三角所预测的寿命长的原因之一（质量寿命三角为哺乳动物的质量和寿命之间提供了很好的关联）。与其他相同质量的哺乳动物相比，人类的性成熟和生殖时间也较晚，并且生殖年龄晚与寿命长相关。最后，人类在发育过程中会产生复杂的结构（如大脑），这种结构会在出生后持续并且在繁殖开始后不久就会持续。显然，长寿命需要大量组织特异性干细胞来在这段时间内再生组织。
质量寿命三角
但是，可以在生命周期内不断替代衰老和濒死细胞的组织特异性干细胞对生物体也有一些不利之处。组织特异性干细胞遍布全身，并在我们的一生中自我繁殖。它们还可以分化为不再复制的终末细胞类型。Irving Weissman表示，这些干细胞“是组织形成、种系发育和癌症发展的自然选择单位” 。人体中干细胞（小肠、结肠和肝脏干细胞）每年复制并积累约40个突变（该值是通过类器官的全基因组测序分析确定的，类器官是从3至87岁的人类供体不同组织克隆的干细胞中获得的）。
当干细胞在调节细胞生长和/或分裂，DNA修复或细胞死亡的途径中积累突变时，可以选择这些细胞，因为其适应性增强，导致更多的细胞分裂或更少的细胞死亡。这种选择增加了包含初始（或截短）突变的干细胞的数量，我们将其定义为组织特异性干细胞选择的第一个突变。
初始突变和选择
最近，我们提出某些癌基因或抑癌基因突变最初在不同的组织特异性干细胞中起作用，进而通过克隆增加组织中的细胞数量，产生一个小的良性肿瘤。一旦发生这种情况，克隆中的初始突变将选择一组特定的次级突变。尽管突变可以以任何顺序发生，但是组织特异性干细胞中其他突变的功能选择以特定顺序发生，然后进一步选择赋予克隆和肿瘤更高适应性的突变。
这种选择首先是在结肠癌中观察到的。在结肠癌中，不同个体中不同基因突变的顺序（APC，RAS，然后是SMAD4突变）引发一系列越来越大的良性肿瘤，随后是TP53中的第四个突变导致恶性肿瘤。这项工作之后，利用正常的组织特异性结肠类器官，使用CRISPR–Cas9将突变引入这些干细胞中，以检测突变顺序对恶性肿瘤产生的影响。这些实验表明，突变顺序对于肿瘤有效产生至关重要，而随机顺序则无效。最终，在小鼠中证明了这种特定顺序最快速地产生结肠癌。组织特异性干细胞和突变顺序在别处也有证明。
突变顺序至关重要
TP53种系突变杂合的Li–Fraumeni综合征患者可以发展为婴幼儿肿瘤，包括脉络丛癌、肾上腺皮质癌、横纹肌肉瘤和某些类型的髓母细胞瘤。青少年和成年患者中最常见的肿瘤是成骨肉瘤、软组织肉瘤、血液肿瘤、神经胶质瘤和胶质母细胞瘤，以及雌激素受体阳性、孕激素受体阳性乳腺癌。老年人最常见的肿瘤是结肠癌和肺癌（图4）。为了解释为什么遗传性TP53突变可再现不同年龄不同组织类型的肿瘤，我们假设在某些组织特异性干细胞（如外胚层和中胚层来源的干细胞）中，初始或截短的TP53突变具有启动良性肿瘤的功能，而在其他组织特异性干细胞（如内胚层来源的干细胞）中，TP53突变不会对表型或细胞分裂造成任何影响，直到其他突变发生。一个典型的例子是在自发性结肠癌中，导致p53功能丧失的TP53突变是在APC、RAS和SMAD4突变后最后发生的一个突变，进而引起恶性转化。相比之下，正常结肠干细胞中TP53的功能丧失突变没有这种影响。这些结果表明癌基因或抑癌基因仅在特定的细胞类型中起作用，才会对细胞生长产生影响。因此，突变顺序对肿瘤的发展很重要。
图4. Li-Fraumeni综合征患者发生特定癌症的风险过高
另一个结果也支持这一假设（图4）。与普通人群相比，在Li–Fraumeni综合征患者中，早期罹患带有TP53遗传突变的癌症的风险大约是外胚层来源的组织（髓母细胞瘤和脉膜丛肿瘤）和中胚层来源的组织（肾上腺皮质癌和横纹肌肉瘤）的癌症发展的250~500倍。在中年（18-45岁）中，患有Li-Fraumeni综合征的女性患者中有50％患上雌激素受体阳性、孕激素受体阳性乳腺癌。这是因为种系TP53突变赋予乳腺癌发展的高风险（乳腺癌发生在外胚层来源的组织中），但此外，这些肿瘤始终需要高水平的雌激素和孕激素来驱动，将肿瘤的发展时间推迟到青春期或成年早期。在自发性乳腺癌中，当TP53突变不是截短突变或初始突变时，TP53突变多见于三阴性亚型。相比之下，内胚层组织中癌症的发生风险（如，Li-Fraumeni综合征患者的结肠癌和肺癌）仅为2-4倍，这些癌症仅在生命的晚期才发生（图4）。有趣的是，在大约70岁的年龄之后，具有TP53基因遗传突变的人患癌症的额外风险低于没有种系TP53突变的人患癌症的风险（图4）。yinqi这些观察结果最简单的解释是，TP53突变可以有效充当初始的截短突变（遗传突变），迅速将外胚层或中胚层来源的组织赋予恶性肿瘤；然而，在TP53突变之前，如果癌基因或抑癌基因没有其他突变，内胚层来源的干细胞中的相同突变就无法启动肿瘤生长。这些流行病学观察表明，与内胚层干细胞相比，外胚层和中胚层干细胞中的p53途径及其功能不同。
一生中，复制的组织特异性干细胞将积累突变。组织特异性干细胞的初始突变赋予的复制优势可导致器官中干细胞或祖细胞的自限性克隆扩增。皮肤或食管上皮细胞中的NOTCH突变导致克隆扩增，产生良性生长，其中某些可能是由各个细胞克隆中的其他突变所产生的癌症的前兆。同样，在扩增的髓系克隆中已鉴定出表观遗传调控基因DNMT3A和TET2以及p53通路基因TP53，PPM1D、ATM和CHEK2突变的髓系前体，突变数随年龄和诱变剂暴露而增加。在此，“早期”失活的TP53突变可能使随后的表观遗传突变发挥作用并增强其表型，包括NRAS、KRAS和FLT3在内的基因发生其他（“晚期”）突变后会发展为急性髓细胞性白血病。
BRCA1和TP53突变
在一系列有序事件中初始突变选择下一个突变的机制是什么？DNA损伤修复基因中既有遗传突变又有自发突变，是这一问题的最佳例证。遗传和自发的BRCA1和BRCA2基因突变（易患卵巢癌和乳癌）通常都带有特定的TP53突变。BRCA1或BRCA2的失活突变导致细胞修复受损DNA的能力降低。受损的DNA被ATM识别，最终导致p53稳定并增加p53依赖的转录和蛋白质-蛋白质相互作用，从而导致凋亡细胞死亡，或BRCA1或BRCA2突变的细胞的DNA修复。因此，在野生型p53的细胞中，BRCA1或BRCA2失活突变的表型效应（可能导致恶性转化）会受到抑制。确实，癌症中许多DNA损伤修复基因的突变与TP53突变同时发生。例如，BRCA1突变的癌症中有70~90％的TP53基因也有突变。BRCA2失活突变的癌细胞表现出DNA损伤，但是与BRCA1突变的肿瘤相比，这些细胞中TP53突变的频率较低，具体原因尚不清楚，但可能涉及可能使p53失活的转录后或翻译后机制。
RAS和TP53突变
在许多RAS突变的肿瘤，例如肺、结肠和胰腺癌中，TP53突变的比例也很高。早期的研究表明，过表达KRAS的大鼠成纤维细胞通常会经历复制性衰老，这一反应可通过同时表达显性负性p53或突变p53导致转化而逆转。特别是，KRAS途径激活导致ARF表达增加，从而抑制MDM2，激活p53稳定和细胞衰老。体内KRAS突变似乎也会激活野生型p53，使干细胞或祖细胞进入衰老状态，这会诱导SASP，导致免疫细胞介导的衰老细胞清除，从而阻止野生型p53存在时表达KRAS的细胞转化。大多数表达KRAS的细胞只有在携带Trp53失活突变时才具有选择优势。野生型TP53的KRAS突变细胞可能通过另一种仍未知的机制使p53蛋白或衰老途径失活。
导致CRC信号通路失控的遗传变化的多样性和频率
PML–p53通路是另一种途径，可以在RAS激活的正常细胞中诱导衰老。在RAS突变的情况下，野生型p53被激活为转录因子，并激活编码PML蛋白的基因的转录（图3），形成核小体，其中p53被组蛋白乙酰化酶乙酰化并启动细胞衰老的转录程序。ARF–p53或PML–p53通路以及各种功能网络（p53途径和表观遗传途径）之间的相互作用将在下一部分中详细讨论。
表观遗传调控和TP53突变
干细胞或祖细胞中的初级突变如何导致选择特定的次级突变的第三个例子是表观遗传调控突变，导致表观遗传活性和修饰发生较大变化，对TP53突变的活细胞可导致p53介导的凋亡选择。这首先Cre介导的DNMT1基因缺失的小鼠中得到证实，DNMT1将甲基转移到CpG二核苷酸中新合成的胞嘧啶残基上，该残基与DNA模板链中的甲基化GpC二核苷酸配对。在Cre介导的重组条件下，DNMT1不会发生CpG甲基化，细胞会失去表观遗传标记，导致两次细胞分裂后细胞凋亡。在这些小鼠中删除Trp53时，细胞不会响应Dnmt1基因敲除而发生凋亡。当一些细胞逃脱这种由p53介导的凋亡并开始分裂时，它们就会变成癌性的。这些实验表明，p53可以检测异常的表观遗传变化，而这些变化会导致细胞死亡。
其他改变表观遗传变化的方法也支持这种解释。例如，在细胞培养中，在人或小鼠成纤维细胞中过表达四种特定的转录因子会导致表观遗传标记的去除和多能干细胞的脱分化。在培养中发生这种情况的效率非常低（0.1~1％），需要数周或数月时间产生这些干细胞。但是，在失去野生型p53蛋白的情况下，效率可以提高到80％，去分化的时间减少到几天。这些实验证明p53蛋白对表观遗传应激作出反应。
第三种实验也支持这种观点。将氮杂胞苷或地西他滨药物掺入RNA和DNA中，从而防止CpG二核苷酸中胞嘧啶残基的甲基化。与表达野生型p53的细胞相比，这些药物杀死具有p53功能丧失或缺乏p53表达的细胞的频率更高。在裸鼠移植瘤模型中也有类似观察。在突变p53的存在下，对这些药物的反应使肿瘤生长减慢，而表达野生型p53的肿瘤对这些药物则无反应。这些观察结果的一种解释是，野生型p53通过防止掺入或修复而在DNA中维持正常的表观遗传标记，而具有p53突变的细胞则不能做到这一点，大量的表观遗传变化会杀死或损害药物处理的细胞。
因此，无论是使用药物、转录因子还是突变来改变细胞DNA中的表观遗传标记，与野生型p53相比，p53的丧失或p53活性降低似乎都使细胞对表观遗传修饰敏感。这三个例子——对DNA修复缺陷的反应、对细胞分裂的忠诚以及对表观遗传功能的监测——将这些信号转导途径与MDM2-p53途径联系起来。
MDM2-p53
至少14个不同的压力信号向MDM2-p53通路中的MDM2传导信息。MDM2和p53的翻译后修饰和蛋白质-蛋白质相互作用导致下游信号转导的微调。高水平p53加上翻译后修饰可诱导多种蛋白质间相互作用并诱导转录程序（图3）。p53的初级转录本位于许多不同途径的节点上，包括调节细胞周期的蛋白质，导致停滞在G1期（p21抑制cyclin E2）或G2期（阻断MDM2介导的CDC25C降解、p53介导的CDC25C转录抑制和p53降低G2-M过渡所需的cyclinB1水平）。这些导致细胞周期停滞的不同机制是MDM2-p53通路冗余的极好例子。细胞周期的M期是由中心体启动有丝分裂纺锤体开始的，而p53直接调节中心体的复制，因此在分裂的细胞中只有两个中心体，以确保染色体的正确分离。
代谢通路是MDM2-p53参与的另一功能网络。p53诱导TP53诱导的糖酵解和凋亡调节剂（TIGAR）的转录，这是一种在肿瘤发生过程中降低糖酵解活性和活性氧（ROS）水平的蛋白质。p53还诱导SCO2（细胞色素氧化酶2），这是一种在细胞核中编码调节线粒体呼吸的蛋白质。p53诱导TIGAR和SCO2总体上降低了癌症代谢的Warburg效应。线粒体中由p53调控的基因编码的蛋白质Parkin在DNA损伤后介导线粒体吞噬并停止ROS活性，对Warburg代谢过程也有相当大的影响。谷氨酰胺酶2（GLS2）是线粒体相关的p53调控基因产物，可将谷氨酰胺转化为谷氨酸，一旦转化为α-酮戊二酸，便进入TCA循环。谷氨酸盐还可以作为谷胱甘肽的前体，从而防止ROS。p53诱导sestrins，这些蛋白进一步将其与ROS调节和mTOR信号转导联系起来。p53调控编码PTEN的基因，5'-AMP激活的蛋白激酶（AMPK）和tuberin（TSC2）的β亚基，可调控哺乳动物mTORC1和mTORC2的靶标，而这对于有效翻译以及细胞生长和分裂的调控至关重要（图3）。因此，通路中与细胞周期和代谢过程的广泛沟通，基因或节点的冗余和反馈循环，确保了通路的稳健性。这里有五个已知的p53调控基因，可降低ROS水平并控制Warburg效应。这些基因或节点中一个甚至两个丢失不会对通路的决策或信息传递产生实质性的影响。这些观察结果还表明，p53途径如何确保细胞组分的忠实复制和细胞周期中的有序进展，同时通过调节代谢过程有效地提供营养和底物。这些当然是达尔文选择、复制和有效利用资源的主要要素。
MDM2-p53通路的强大之处
MDM2-p53通路的强大之处在于提供备用功能。因此，如果通路或节点中的某个元素发生故障，则可以使用第二种甚至第三种方式来弥补功能的初始损失。例如，在各种各样的组织特异性干细胞中，可能会发生四个或五个突变，每个突变都在不同的功能途径中并以特定顺序进行选择，以产生恶性肿瘤。即使在儿科癌症中，很少有一个突变事件会引起癌症。
出人意料的是，尽管野生型MDM2-p53调控下游基因网络的能力确实很强大，但突变引起的p53丢失却切断了整个途径。p53突变通路似乎没有这种强大的备用能力。如果单个突变使整个途径及其所有有用信息失活，那么这个途径就不可靠。为什么还会以这种方式进化？在p53网络中，许多不同类型的压力都连接到由MDM2和p53蛋白组成的单个节点，它们以振荡的方式相互连接。p53通过激活MDM2转录来启动自身的降解（图3）。
为什么TP53是人类癌症中最常见的突变基因？
对于现有结构（所有输入和输出都有一个p53节点），一种常见的解释是，同时发生的多种不同的压力和信号需要传递到p53节点，以调整细胞对各种压力组合的响应。
比如，如果有两种压力发生，就需要两个独立的信号来修饰一个p53蛋白的两个位置，或者需要两个信号来修饰十个类似p53的蛋白中的两个。两种途径的步数相同。接下来，修饰后的单个p53蛋白会因蛋白修饰而改变构象，与适当的基因结合以产生联合应答，从而解决这一问题。但是，十个p53样蛋白结构必须在十个节点之间发出信号，以确定哪些蛋白被修饰，然后用三个独立的转录因子做出适当的反应组合。这需要在路径中采取许多额外的步骤，错误的机会增加，信息内容的质量会降低。单一的中央信息集成可以为通路提供更好的架构。
压力和压力大小的沟通不当，如DNA损伤，可能会导致细胞损伤严重时无休止地试图修复DNA，而正确的反应是细胞死亡。不断修复其DNA的细胞无法如实复制。这表明，进化很可能选择了一个单一的MDM2 p53枢纽，因为它选择了由p53控制的细胞、组织和器官的常见压力组合。
这些整合压力输入和输出的高级功能解释了p53肿瘤抑制不是简单地由一个、两个或三个p53靶基因介导的，而是由p53介导的转录反应的组合。由于该通路具有冗余性，下游一个或两个p53靶基因的缺失可以通过高阶整合有关应激反应的信息来弥补。因此，p53介导的肿瘤抑制是对环境变化的整合和调节反应的协调集合，从而导致修复和细胞体内平衡。
参考文献：Levine, A.J. p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery.Nat Rev Cancer(2020).