對於人類二倍體細胞中的46條染色體，其中23條來自母本，23條來自父本，共攜帶了包含30億對鹼基的基因組DNA, 全長近2米。看似繁雜的DNA鏈卻能規律地摺疊在直徑約5微米的細胞核內，並完成所有的基因組“編碼”功能。基因組三維（3D）結構對於基因表達調控和細胞功能具有重要作用。此外，基因組3D結構研究是國家重大需求和國際科學前沿，但我們對人類基因組3D結構的認識才剛剛起步。
隨著測序技術的發展，染色質構象捕獲技術，例如3C和Hi-C等，可以通過相鄰DNA之間的互作（contact）來研究其基因組的3D結構。不同細胞間的差異只能通過單細胞測定才能檢測到。然而，從單細胞層面破譯人類二倍體細胞基因組的3D結構一直未能實現。
2018年8月31日，國際頂級學術期刊Science發表了人類細胞基因組3D結構研究的最新成果。謝曉亮教授的哈佛大學團隊利用新開發的Dip-C方法，包括全新的單細胞基因組擴增方法META和適用於解釋二倍體結構的軟件，在高分辨率下，重建了來自淋巴母細胞系和原代血細胞的人類二倍體單細胞基因組的3D結構，定位了細胞核中特定單核苷酸變異和拷貝數變異。這是國際上首次成功破譯人類二倍體單細胞基因組的3D結構，並發現不同細胞類型之間存在系統差異。8月31日，Science雜誌還特別推出技術轉化生物學（Technologies Transforming Biology）特刊，其中便對謝曉亮教授開發的這種革命性的基因組三維結構重建技術Dip-C進行了報道。謝曉亮教授已於今年7月全職回北京大學工作，任北京大學李兆基教授和北京未來基因診斷高精尖創新中心（ICG）主任。
研究通訊作者謝曉亮教授表示：“人類每個細胞的細胞核中都包裹著長達2米的DNA，基因組3D結構對於細胞的很多功能都非常關鍵。然而
到目前為止二倍體細胞的3D結構一直未被破譯，這主要是因為來自於母本的23條染色體與來自父本的23條染色體幾乎無法區分。利用Dip-C的方法，我們首次獲得了單個二倍體人類細胞基因組的3D結構，並且發現了不同細胞類型存在的系統差異。這是針對細胞核的一種結構生物學新方法，將在生物醫學很多領域有重要的應用。”想要成功重建高分辨率的基因組3D結構，就要解析染色質中大量的DNA互作位點。為此，研究團隊開發了一種新的單細胞染色質構象捕獲方法Dip-C，與現有方法相比，該方法能夠檢測出更多的染色質互作，且假陽性率極小。此外，研究團隊捨棄了生物素捕獲這一操作，而是利用多重末端標記擴增技術（META）進行高覆蓋率的全基因組擴增，避免了人工嵌合體的引入。Dip-C捕獲單細胞染色質構象流程見圖1。
圖1. Dip-C捕獲單細胞染色質構象示意圖
利用上述方法，在GM12878細胞系（一種女性淋巴母細胞細胞系）檢測試驗中，研究人員在每個單細胞中檢測到104萬個染色質互作。在來源於男性的外周血單核細胞（PBMCs）中，平均互作數為84萬個，是現有方法所能達到的平均數的5倍。此外，該研究在10kb的分辨率下，檢測了拷貝數變異（CNVs）、雜合缺失（LOHs）、DNA複製以及V(D)J重組等事件。
重建二倍體單細胞基因組3D結構的另一難題是確定每個染色質互作中包含的單倍型有哪些。為此，謝曉亮研究團隊開發了一種基因型填補算法，該方法可以通過填補每個互作的單倍型來權衡鄰近互作點的單倍型。經交叉驗證，每一種單倍型的基因型填補準確率約為96%，並能夠在結構重建過程中排除某些受損細胞。
圖2. GM12878細胞系二倍體單細胞基因組3D結構圖
在解決了技術難題後，研究團隊利用Dip-C方法，首次成功重建了人類二倍體單細胞基因組3D結構，分辨率為20kb。結果顯示，94%的GM12878細胞（16箇中有15個）構建成功，（見圖2）67%的PBMC細胞構建成功，並移除了一小部分問題細胞，包括6%（16箇中有1個）的GM12878細胞和22%（18箇中有4個）的PBMC細胞。
由於染色質構象捕獲存在內部損失和噪音，該研究重建的基因組3D結構包含一些不確定因素，包括實驗中染色質結構的干擾、3D建模過程中能量函數的誤差、細胞核容積原因導致無法進行DNA測序（例如著絲粒、核仁、核散斑體）。這些不確定因素在所有的3C/Hi-C研究中都很常見，而且難以評估。當兩個同源染色體十分靠近或者具有相似性狀時，基因型填補方法可能就沒有那麼成功了，因此，其他問題區域可能在人工排除後仍然存在。
圖3. 母體和父體等位基因的3D結構不同
通過進一步檢測母本和父本等位基因間的結構關係，該研究在單細胞水平證實，基因組印記引起的兩個等位基因有著不同的基因組結構，兩個等位基因在轉錄活性上存在較大差異（見圖3）。此外，該研究還發現不同細胞類型的整體染色質混合範圍存在差異。儘管細胞間存在異質性，但來自母本的等位基因會更頻繁的將IGF2和H19以及鄰近的HIDAD位點進行分離，破壞IGF2-HIDAD CTCF loop結構，而來自父本的等位基因則更多的維持完全混合狀態。
此外，該研究發現不同類型的細胞有著不同的基因組結構，這種結構分型對研究細胞功能有著至關重要的作用。癌症、遺傳病的相關基因突變也可能破壞鄰近區域的染色質結構。空間定位基因組變異的能力對於研究癌症和遺傳病至關重要。藉助該研究獲得的基因組3D結構，研究人員可以精確描述基因組改變在細胞核中的精確位置。
值得一提的是，該研究利用Dip-C方法以全面視角分析了不同基因組尺度下染色質隨機、分形組成。雖然大量Hi-C研究發現染色質形成具有區室和結構域的“分形小球”，例如拓撲締合結構域（TAD）和CCCTC結合因子（CTCF）環結構域，但迄今為止還沒有一種全基因組技術能檢測人類單細胞中的這類分型。
該研究利用新開發的Dip-C技術，發現了每個染色體上連續的染色質顆粒的空間聚類和分隔，並發現這種分形可以通過每個染色體上所有可能子鏈的旋轉半徑矩陣進行量化。人類二倍體單細胞基因組3D結構的成功破譯有助於揭示細胞群體差異和細胞的進化路線，幫助科學家預測突變元件與靶基因之間的關係，也將幫助人類進一步探索細胞分化、癌變、記憶以及衰老等問題。
參考文獻：
1. Tan L, Xing D, Chang C, Li H, Xie XS. (2018). Three-dimensional genome structures of single diploid human cells. Science,361: 924-8.
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