隨著新冠病毒的全球肆虐，如何在針對疑似樣本的大規模檢測中，既能提高檢測靈敏度，又能獲得病毒全基因組序列以用於後續變異監測和研究，中國科學家於2020年3月16日預印在bioRxiv的一篇文章《Multiple approaches formassively parallel sequencing of HCoV-19 genomes directly from clinical samples》給出了答案。
文章分別採用宏基因組測序（Meta）、探針捕獲測序（Capture）和多重PCR捕獲測序（Amplicon）等三種方法對8例梯度稀釋的病毒培養物（Ct值17.3-39.9）和8例新冠病毒臨床樣本（Ct值18-32，包括咽拭子，喉拭子，鼻拭子，肛拭子和唾液樣本）進行了檢測對比。首先採用宏基因組方法對臨床樣本進行了超高通量測序，每個樣本產出>300Gb數據，其中病毒reads佔總reads比例僅0.002%-5.513%。
樣本數據量要求
在同時滿足全基因組95%覆蓋度以及10X測序深度的情況下：在病毒梯度稀釋樣本中(102-106copies/ml)進行探針捕獲測序需要5.3Mb-14Gb數據，進行多重PCR捕獲測序需要33Mb-973Mb數據；在臨床樣本中，進行探針捕獲測序需要12Mb-25Gb數據，進行多重PCR捕獲測序需要32Mb-1.8Gb數據，而宏基因組需要129Mb-334Gb數據。
表1一定深度下三種方法所需要的數據量
滿足高要求下游分析的情況下(捕獲≥20X，多重≥100X，宏基因組≥10X，覆蓋度≥95%)，在病毒梯度稀釋樣本中(102-106copies/ml)，捕獲需要8Mb-24Gb數據，多重需要185Mb-2.7Gb數據；在臨床樣本中，捕獲需要23Mb-25Gb數據，多重需要261Mb- 1.8Gb數據，而宏基因組需要129Mb-334Gb數據。
表2滿足下游深度分析三種方法所需要的數據量
通過對比可知，多重PCR捕獲測序方法在不同病毒載量樣本中所需要的數據量差異更小，在低病毒載量要求的數據量更少。
病毒載量檢測靈敏度
採用華大智造SARS-CoV-2 full length genome panel試劑盒，對梯度稀釋的病毒培養物（Ct值17.3-39.9）和臨床樣本（Ct值18-32，包括咽拭子，喉拭子，鼻拭子，肛拭子和唾液樣本）進行檢測對比，結果表明：對於高病毒載量（≥105copies/ml），探針捕獲測序和多重PCR捕獲測序都有很好的富集效果（相對於宏基因組方法分別獲得了5596倍和5710倍富集）；而在低病毒載量的樣本中（≤104copies/ml，Ct值≥28.7）多重PCR捕獲測序的富集效果是探針捕獲測序的10-1000倍。這一結果表示，在低病毒載量的情況下，多重PCR捕獲測序具有更好的檢測靈敏度。
#RPM-每M數據中病毒的數據的比例
圖1三種方法對病毒富集的效果
突變檢測準確性
在臨床樣本中，基於多重PCR捕獲測序和宏基因組測序方法都檢測到19個突變位點，而探針捕獲測序只檢測到18個位點，漏檢一個點，並且該位點對應的樣本病毒載量低（Ct 值30）。這一結果表明多重PCR捕獲測序方法相對更為準確，特別是在極端樣本情況下。
圖2 三種方法突變檢測結果
結論
綜上，基於高通量測序的三種方法選擇指導：
1.如果研究者想要研究除目標微生物外其他的病原微生物，並且病毒載量≥ 105copies/ml或Ct值≤ 24.5，推薦宏基因組測序；2.如果研究者只想研究目標微生物，比較有挑戰的樣本譬如病毒載量<105 copies/ml或Ct值>24.5,推薦探針捕獲測序(關注次要鹼基突變和鹼基頻率)和多重PCR測序（關注主要鹼基突變）；3.如果研究者只想研究目標微生物，並重點關注主要鹼基突變，樣本極具挑戰性，病毒載量低至102copies/ml或Ct值高至35，推薦多重PCR測序。
目前，針對以上三種方法，華大智造DNBSEQ平臺均已推出配套整體解決方案。特別地，在該文中採用的SARS-CoV-2 full length genome panel試劑盒基於華大智造ATOPlex多重定製化服務平臺打造。該試劑盒除了應用於全基因組組裝、病毒變異檢測、進化研究外，還能夠應用於極端新冠樣本的檢測，最低僅需1M Reads就可獲取病毒全基因組信息，其表現出比常規RT-PCR更高的靈敏度，能夠滿足RT-PCR假陰性樣本的二次檢測、複核確診和大規模疑似樣本檢測的需要。
關於SARS-CoV-2 full length genome panel試劑盒
基於鎖定引物的2步PCR，特異性強，中間不需要額外的消化步驟，操作簡單；能夠在一管中實現病毒全基因的擴增，不需要分管操作；加入已知拷貝數人工合成外參DNA，並同時進行病毒基因和外參DNA的檢測，用於病毒的載量確定；加入看家基因檢測，可以用於病毒載量相對於細胞含量的確定，有助於病毒細胞病理學研究；雙唯一barcode結合DNBSEQ測序，最大程度降低barcode串擾，降低平行測序過程中強陽性樣本對弱陽性或陰性樣本的汙染。
關於ATOPlex多重PCR定製化服務平臺
ATOPlex多重PCR定製化服務平臺是華大智造自主研發的以超高重PCR技術為核心的產品定製平臺。該平臺涵蓋了DNA、RNA和DNA甲基化方向，可以滿足科研、醫藥、司法、農業、DTC等相關領域的個性化基因檢測產品定製。ATOPlex多重PCR定製產品平臺提供產品設計、建庫試劑，此外，還可以提供該產品基於MGISP-100或者MGISP-960的自動化建庫解決方案。
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