鳥類學家們從進一步研究發現，貓頭鷹的聽覺非常靈敏，在伸手不見五指的黑暗環境中，聽覺起主要的定位作用。貓頭鷹的左右耳是不對稱的，左耳道明顯比右耳道寬闊，而且左耳有很發達的耳鼓。大部分貓頭鷹還生有一簇耳羽，形成像人一樣的耳廓。貓頭鷹的聽覺神經很發達，一個體重只有300克的倉鴞約有9.5萬個聽覺神經細胞，而體重600克左右的烏鴉卻只有2.7萬個。
另外，貓頭鷹臉部密集著生的硬羽組成面盤，而這個面盤是很好的聲波收集器。貓頭鷹碩大的頭使兩耳之間的距離較大，這可以增強對聲波的分辨率。當一隻貓頭鷹在黑暗的環境中搜索獵物時，它對聲音的第一個反應是轉頭，如同我們在聽微小響動時側耳傾聽一樣。但是貓頭鷹並不是真正地側耳傾聽，它轉頭的作用是使聲波傳到左右耳的時間產生差異。當這種時間差增加到30微秒以上時，貓頭鷹即可準確分辨聲源的方位。貓頭鷹一旦判斷出獵物的方位，便迅速出擊。貓頭鷹的羽毛非常柔軟，翅膀羽毛上有天鵝絨般密生的羽絨，因而貓頭鷹飛行時產生的聲波頻率小於1千赫，而一般哺乳動物的耳朵是感覺不到達麼低的頻率的。
這樣無聲的出擊使貓頭鷹的進攻更有“閃電戰”的效果。據研究，貓頭鷹在撲擊獵物時，它的聽覺仍起定位作用。它能根據獵物移動時產生的響動，不斷調整撲擊方向，最後出爪，一舉奏效。當然，貓頭鷹在捕食中視覺和聽覺的作用是相輔相成的，它正是在各方面適應夜行生活而成為一個高效的夜間捕獵能手。
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