Western blots是学术不端里面最常见被“放大镜”观察的一个地方，作为科学研究里的一种简单而又“不简单”的技术，Elisabeth Bik教授做了详细的讲解。
近来，Elisabeth Bik团队曝出的400篇涉嫌造假论文，里面主要线索就是Western blots的图像（参见： ）。
科学论文中的许多图像问题（复制、操作）都是在Western blots中发现的。Western Blots是研究蛋白质的标准实验室技术，蛋白质是所有生物体的三个基本组成部分之一（另外两个是DNA和RNA。）
这三种方法中，第一种被密切调查的是DNA，使用的是英国分子生物学家Edwin Southern于1975年发明的一种方法，因此被称为“Southern Blotting”。
在这种只有科学家才会想到的笑话中，后来为RNA和蛋白质开发的分析工具相应地被命名为“Northern Blotting”和“Western Blotting”。
（纯粹主义者可能会注意到，由于只有三个组成部分，所以没有“Eastern Blotting”。）
DNA–RNA–蛋白质
所有生物体（植物、动物、细菌等）中的三种基本分子类型是：
DNA：一种双链、螺旋形的非常长的分子，储存遗传信息。这些长长的DNA链一起形成了一个有机体的基因组。
RNA：一种单股螺旋状分子。它的形状和信息与DNA相同，但它是由不同的分子组成的。它作为一种短命的、暂时的信使分子，可以复制储存在DNA中的一部分信息，作为构建新蛋白质的蓝图。
蛋白质：一种球状、折叠的氨基酸链，是细胞或酶的结构部分，能进行化学反应，制造或分解其他分子，如多糖或脂类。
这幅伟大的漫画摘自Jaclyn Taroni在儿童癌症数据实验室博客上的一篇文章，DNA就像一本食谱丰富的烹饪书，RNA是一个单一的食谱，蛋白质是菜肴（还有纸杯蛋糕！）它们是按照配方制备的，而细胞和组织则由许多这些准备好的盘子组成。
(Source: Jaclyn Taroni – Childhood Cancer Data lab.
Found at: https://www.ccdatalab.org/blog/2019/7/1/how-does-big-data-help-us-tackle-childhood-cancer)
研究蛋白质
研究蛋白质的生物学家有时想知道蛋白质有多大，在特定的细胞类型或组织中发现了多少蛋白质，或者细胞中某些蛋白质的数量是如何随着药物治疗或疾病的反应而变化的。为了了解这些，他们可以使用一种叫做Western blot的分子技术。
第一步：蛋白质凝胶电泳
在研究人员进行Western blotting之前，蛋白质需要在SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）过程中分离。在这项技术中，蛋白质样本在一种叫做“凝胶”的类似果冻的物质中按长度分离。这个过程有几个步骤：
1.首先，将细胞或组织均匀化并进行预处理，使每个样品由不同蛋白质的液体混合物组成。
2.蛋白质混合物与肥皂状的清洁剂溶液SDS混合，使其展开和拉伸，并用负电荷覆盖。
3.蛋白质/洗涤剂混合物装在“凝胶”的顶部，这是一层薄薄的（约1毫米）类似于果冻的物质，称为聚丙烯酰胺，倒在两个玻璃板之间。多个蛋白质混合物可以在凝胶顶部被称为“槽”的小孔中相邻装载（见下图）。
4.施加电流，正极位于凝胶底部。结果，所有带负电的蛋白质都想移动到凝胶的底部。样品从凝胶的顶部缓慢地移动到底部，每个样品在一个单独的“通道”中，就像运动员在跑道上跑步一样。
5.然而，这种凝胶材料类似于一片茂密的丛林，使得蛋白质很难跑到底部的正极。长蛋白质比小蛋白质在丛林中生存的时间要长。因此，在施加电荷一段特定时间后，小蛋白质比大蛋白质移动得更接近底部，因此移动得更慢。这样蛋白质的复杂混合物就可以按长度分离。
6.当最小的蛋白质到达凝胶的底部时，电极被移除，用来固定凝胶的玻璃板被相互剥离。
7.凝胶现在可以染色以显示所有蛋白质（例如，用考马斯亮蓝或胭脂红染料），或者凝胶可以通过Western blotting检测一种或几种蛋白质。
(Separating proteins in an SDS PAGE gel by length.
Source: http://infoupdate.org/sds-page-gel-recipe/)
蛋白印迹法
在Western blotting过程中，分离的蛋白质被转移到膜上，然后与特定抗体一起孵育，以研究均质样品中许多蛋白质混合物中的一种或几种蛋白质。这种膜比含有蛋白质的果冻状凝胶要坚固得多，这种凝胶很容易破裂或撕裂。
1.首先，将含有蛋白质的凝胶放在一个薄膜上，薄膜看起来像一张小纸片。这种膜由硝化纤维或聚偏氟乙烯（PVDF）制成，蛋白质很容易与之结合。
2.凝胶中的蛋白质通过“印迹”转移到膜上。有几种方法可以做到这一点，要么在堆积的凝胶/膜上加一个砝码，等待蛋白质与膜结合，要么施加电流。
3.这种膜，现在被称为“印迹”，与一种针对特定蛋白质的抗体一起孵育。假设你想研究一种叫做EGF的蛋白质的含量。因此，你可以用一种抗EGF的抗体来孵化这个印迹，这种抗体被称为“抗EGF”。
4.抗体将结合在EGF位于印迹上的位置。如果是一个小蛋白，EGF将位于印迹的底部。
5.用抗体孵育印迹后，冲洗膜，以洗去任何未结合的抗体。
6.然后用与第一种抗体结合的第二抗体孵育膜，以放大信号。这种二级抗体具有放射性或化学发光基团，使其在X射线胶片、感光胶片或数字扫描仪上可见。
7.该膜现在将在最初感兴趣的蛋白质（如EGF）的位置包含窄的水平条纹。通常，每条通道都有一条水平条纹。我们称这些条纹为“条带”。
(Western Blotting.
Source: https://www.mybiosource.com/learn/westernblotting)
凝胶、斑点、通道和带
在蛋白质凝胶中，样品中的所有蛋白质都是按长度分离的。在下面的图片中，你看到一种凝胶，左边有6个“通道”。 通道1由一种人工的，商业上可买到的10种不同大小的已知蛋白质的混合物组成，称为“标记物”。通道2-6由数千种不同大小的蛋白质组成的复杂样品混合物组成。凝胶用一种与所有蛋白质结合的青色染料处理。
在右边，你可以看到左边的凝胶的复制品，一个已经转移到膜上，然后用一种特殊的抗体，即针对一种叫做CDK7的蛋白质进行孵化。尽管2-6通道中存在1000种不同的蛋白质，但只有CDK7蛋白带可见（有几个“诀窍”使标记带可见）。因此，尽管CDK7蛋白在1000种其他蛋白的混合物中几乎看不到，Western blot技术允许我们以高精度和高灵敏度研究它。
Western blot条带的厚度/强度是对特定样本中蛋白质含量的测量。凝胶中的位置（靠近印迹的顶部或底部）是衡量蛋白质大小的指标。由于标记蛋白（在第1道）的大小是已知的，我们可以估计未知蛋白的大小。
负载控制蛋白
Western blot可以去除抗体，然后与不同的抗体重新孵育以研究不同的感兴趣蛋白。这个过程可以重复几次。
为了确保所有通道都装载了相同数量的总蛋白，并且为了获得感兴趣蛋白质数量的分母，其中一个重复的westernblot可能涉及查看装载控制蛋白。这是一种蛋白质，在一种细胞或组织类型中，它的含量总是相同的，与实验无关。
典型的控制蛋白是β-肌动蛋白、GAPDH、AKT或α-微管蛋白。这些是真核细胞功能所必需的“家庭”蛋白质。通常情况下，负荷控制培养显示在图的底部，带有多个Western blot面板。
在下面的图片中，你可以看到4种蛋白质（A-D）的数量在不同的实验（1-8）之间变化，而微管蛋白（底部面板）的数量保持相当恒定。
每个条带都应该是独一无二的
正如你在上一段中看到的那样，Western blot条带的形状和间距是非常可变的。条带的形状可以像煎饼、哑铃、鱼、蠕虫、木屐、蝴蝶结、W、M、微笑的嘴，或者你在里面看到的任何东西。形状取决于研究人员如何将样本装载到凝胶上，蛋白质的数量，以及凝胶装置的特性。然后你可能会注意到凝胶带和背景中的斑点、污渍、斑点、划痕、气泡和其他不规则现象。所有这些变化导致条带看起来都有点不同。就像岩石，树叶，脸一样，每一个条带都是独一无二的。当然，这完全取决于印迹照片的分辨率和曝光度。
因为Western blot条带应该是唯一的，所以人们可以通过视觉检查blot照片并检测出看起来比预期更相似的条带——这可能暗示着重复或操作。
在下图中，你能在面板A和D中检测到一些看起来比预期更相似的波段吗？
(Four Western Blot panels, each representing a different protein (A through D) in 5 different E. aerogenes strains (1-5). Can you detect some bands that look more similar than expected in panels A and D?)
为什么叫Western blotting？
“Western”blot这个名字来源于1975年Edwin Southern开发的一种古老的技术，叫做“Southern blotting”。在Southern杂交中，DNA被转移到膜上，并用探针进行检测。两年后的1977年，一种类似的检测RNA的技术被称为“Northern”印迹法，这有点像一个笑话，但这个名字一直沿用至今。1979年前后，当三个不同的实验室开发出一种类似的技术来转移和检测特定的蛋白质时，“Western”印迹法似乎是一个明显的名字。既然生命只有三个基本分子，就没有“Eastern blotting”！
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