DNA轉錄及其調控是基因表達的關鍵步驟【1】。2013年，William Greenleaf和Howard Chang團隊共同開發ATAC-seq方法【2】，實現了對基因組開放性及轉錄因子(transcription factor)結合狀態的高效精準檢測。然而，目前對DNA轉錄活性的檢測仍主要基於Pol II ChIP-seq、GRO-seq（Global nuclear Run-On sequencing，一種專門測量新生 RNA 的方法）【3】或nascent RNA-seq等間接手段。這些方法往往需要大量細胞作為起始材料，操作複雜，並且難以直接反映RNA聚合酶活性及其動態變化。
2020年2月，芝加哥大學何川團隊在Nature Chemical Biology上報道了N3-kethoxal分子的合成及其在RNA二級結構檢測中的應用【4】。N3-kethoxal分子能夠在5分鐘內特異性的和活細胞中單鏈狀態的鳥嘌呤(G)反應，被修飾的RNA片段可以藉助"click chemistry"和biotin-streptavidin相互作用富集。N3-kethoxal修飾是可逆的，加熱後即可被去除。基於這一前期工作，作者猜想N3-kethoxal在單鏈DNA上具有相似的反應活性，並可以通過特異性標記RNA聚合酶產生的單鏈DNA區域(transcription bubble)檢測DNA轉錄。
2020年4月6日，何川團隊在Nature Methods上發表了題為Kethoxal-assisted single-stranded DNA sequencing captures global transcription dynamics and enhancer activities in situ的工作。Kethoxal-assisted single-stranded DNA sequencing，簡稱KAS-seq，可以在1000個細胞或冷凍小鼠組織中對轉錄以及其他過程中產生的單鏈DNA實現快速、靈敏、操作簡單的檢測。吳桐和呂瑞途為本文的共同第一作者。
在KAS-seq實驗過程中，作者將N3-kethoxal加入細胞培養液中五分鐘後提取DNA，富集被N3-kethoxal標記的DNA片段並建庫測序。整個實驗過程可在一天之內完成。
作者發現，KAS-seq信號顯著富集在基因編碼區，並在啟動子上與ATAC-seq以及標記活躍轉錄的組蛋白修飾信號高度重合。在gene body上，KAS-seq信號與H3K36me3信號相吻合，而ATAC-seq以及基於KMnO4氧化的ssDNA-seq在此區域均沒有信號，說明KAS-seq具有極高的靈敏度。當Pol II延伸被抑制時，KAS-seq信號僅出現在啟動子；而當Pol II結合被抑制時，KAS-seq信號在基因編碼區完全消失。使用KAS-seq信號定義的四種基因轉錄狀態與使用GRO-seq定義得到的結果相吻合(GRO-seq需使用百萬細胞)。KAS-seq也同時檢測Pol I 和Pol lIII介導的轉錄活性。這些證據表明，KAS-seq可準確檢測全基因組DNA轉錄活性。
除此之外，KAS-seq信號也出現在一部分增強子(enhancer)上 。作者將這些增強子定義為
single-stranded DNA-containing enhancer (SSE)。作者發現，SSE具有獨特的序列特徵(motif)。一些轉錄因子對結合SSE具有強偏好性，且SSE對與其相關的基因具有更強的調控作用。這些增強子很有可能是真正有活性的增強子。作者將KAS-seq用於抑制相分離條件下轉錄變化的動態檢測中。作者發現，加入相分離抑制劑後，細胞的整體轉錄活性降低，這一點與前人的研究結果相似。然而，在加入相分離抑制劑5分鐘後，一部分啟動子上的Pol II被釋放到gene body上 。這些被釋放的Pol II以顯著低於正常轉錄時的速度向下遊移動並逐漸消失。這一實驗揭示了KAS-seq在檢測生物體動態、瞬時轉錄變化過程時的強大作用 。KAS-seq未來可以廣泛運用在轉錄變化的動態檢測中。
值得一提的是，KAS-seq還可以用於低起始量細胞或冷凍動物組織中單鏈DNA的檢測， 並有可能用於活體動物上。使用1000個細胞產生的KAS-seq數據與使用大量細胞產生的數據具有相似的結果。
總之，KAS-seq提供了一種簡單、低起始量、高靈敏度的單鏈DNA測序方法。這一方法可在同一個實驗中同時檢測轉錄活性、增強子活性以及DNA拓撲結構的變化，並且尤其適用於珍貴樣品、醫療樣品以及動態變化過程。隨著技術的持續優化，KAS-seq有望實現在單細胞，甚至單分子層面的單鏈DNA檢測。KAS-seq或將成為轉錄以及其他單鏈DNA過程研究中不可或缺的工具 。KAS-seq 的簡單操作使其具有極大的臨床應用前景。
原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41592-020-0797-9
參考文獻
1. Schwanhäusser, B. et al. Global quantification ofmammalian gene expression control.Nature 473, 337–342 (2011).
2. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C.,Chang, H. Y. & Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fastand sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins andnucleosome position. Nat. Methods 10, 1213–1218 (2013).
3. Core, L. J., Waterfall, J. J. & Lis, J. T.Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation athuman promoters. Science 322, 1845–1848 (2008).
4. Weng, X. et al. Keth-seq fortranscriptome-wide RNA structure mapping. Nat. Chem. Biol. https://doi.org/10.1038/s41589-019-0459-3(2020).
閱讀更多 BioArt 的文章
