DNA转录及其调控是基因表达的关键步骤【1】。2013年，William Greenleaf和Howard Chang团队共同开发ATAC-seq方法【2】，实现了对基因组开放性及转录因子(transcription factor)结合状态的高效精准检测。然而，目前对DNA转录活性的检测仍主要基于Pol II ChIP-seq、GRO-seq（Global nuclear Run-On sequencing，一种专门测量新生 RNA 的方法）【3】或nascent RNA-seq等间接手段。这些方法往往需要大量细胞作为起始材料，操作复杂，并且难以直接反映RNA聚合酶活性及其动态变化。
2020年2月，芝加哥大学何川团队在Nature Chemical Biology上报道了N3-kethoxal分子的合成及其在RNA二级结构检测中的应用【4】。N3-kethoxal分子能够在5分钟内特异性的和活细胞中单链状态的鸟嘌呤(G)反应，被修饰的RNA片段可以借助"click chemistry"和biotin-streptavidin相互作用富集。N3-kethoxal修饰是可逆的，加热后即可被去除。基于这一前期工作，作者猜想N3-kethoxal在单链DNA上具有相似的反应活性，并可以通过特异性标记RNA聚合酶产生的单链DNA区域(transcription bubble)检测DNA转录。
2020年4月6日，何川团队在Nature Methods上发表了题为Kethoxal-assisted single-stranded DNA sequencing captures global transcription dynamics and enhancer activities in situ的工作。Kethoxal-assisted single-stranded DNA sequencing，简称KAS-seq，可以在1000个细胞或冷冻小鼠组织中对转录以及其他过程中产生的单链DNA实现快速、灵敏、操作简单的检测。吴桐和吕瑞途为本文的共同第一作者。
在KAS-seq实验过程中，作者将N3-kethoxal加入细胞培养液中五分钟后提取DNA，富集被N3-kethoxal标记的DNA片段并建库测序。整个实验过程可在一天之内完成。
作者发现，KAS-seq信号显著富集在基因编码区，并在启动子上与ATAC-seq以及标记活跃转录的组蛋白修饰信号高度重合。在gene body上，KAS-seq信号与H3K36me3信号相吻合，而ATAC-seq以及基于KMnO4氧化的ssDNA-seq在此区域均没有信号，说明KAS-seq具有极高的灵敏度。当Pol II延伸被抑制时，KAS-seq信号仅出现在启动子；而当Pol II结合被抑制时，KAS-seq信号在基因编码区完全消失。使用KAS-seq信号定义的四种基因转录状态与使用GRO-seq定义得到的结果相吻合(GRO-seq需使用百万细胞)。KAS-seq也同时检测Pol I 和Pol lIII介导的转录活性。这些证据表明，KAS-seq可准确检测全基因组DNA转录活性。
除此之外，KAS-seq信号也出现在一部分增强子(enhancer)上 。作者将这些增强子定义为
single-stranded DNA-containing enhancer (SSE)。作者发现，SSE具有独特的序列特征(motif)。一些转录因子对结合SSE具有强偏好性，且SSE对与其相关的基因具有更强的调控作用。这些增强子很有可能是真正有活性的增强子。作者将KAS-seq用于抑制相分离条件下转录变化的动态检测中。作者发现，加入相分离抑制剂后，细胞的整体转录活性降低，这一点与前人的研究结果相似。然而，在加入相分离抑制剂5分钟后，一部分启动子上的Pol II被释放到gene body上 。这些被释放的Pol II以显著低于正常转录时的速度向下游移动并逐渐消失。这一实验揭示了KAS-seq在检测生物体动态、瞬时转录变化过程时的强大作用 。KAS-seq未来可以广泛运用在转录变化的动态检测中。
值得一提的是，KAS-seq还可以用于低起始量细胞或冷冻动物组织中单链DNA的检测， 并有可能用于活体动物上。使用1000个细胞产生的KAS-seq数据与使用大量细胞产生的数据具有相似的结果。
总之，KAS-seq提供了一种简单、低起始量、高灵敏度的单链DNA测序方法。这一方法可在同一个实验中同时检测转录活性、增强子活性以及DNA拓扑结构的变化，并且尤其适用于珍贵样品、医疗样品以及动态变化过程。随着技术的持续优化，KAS-seq有望实现在单细胞，甚至单分子层面的单链DNA检测。KAS-seq或将成为转录以及其他单链DNA过程研究中不可或缺的工具 。KAS-seq 的简单操作使其具有极大的临床应用前景。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41592-020-0797-9
参考文献
1. Schwanhäusser, B. et al. Global quantification ofmammalian gene expression control.Nature 473, 337–342 (2011).
2. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C.,Chang, H. Y. & Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fastand sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins andnucleosome position. Nat. Methods 10, 1213–1218 (2013).
3. Core, L. J., Waterfall, J. J. & Lis, J. T.Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation athuman promoters. Science 322, 1845–1848 (2008).
4. Weng, X. et al. Keth-seq fortranscriptome-wide RNA structure mapping. Nat. Chem. Biol. https://doi.org/10.1038/s41589-019-0459-3(2020).
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