原創 Jione、song 微生態 2019-10-06
導讀
霍亂弧菌是流行性腹瀉霍亂的病原體，已有報道顯示霍亂毒素（CT）和毒素緻密菌毛（TCP）是主要的毒力決定因素，而且其致病機制為與土著微生物相互作用有關。而腸道微生物群的一個關鍵的特點是其對腸致病菌的感染的保護能力，稱為“抗菌能力”。腸道內微生物物種互作的內在因素是群落組成，包括細菌間的競爭和抗菌物質的分泌；而外源因素包括炎症、飲食和抗生素治療。但腸道微生物群的擾動如何損害宿主對感染病原體的抵抗力尚不明確，尤其表現在通過物種和代謝產物水平的變化。本研究從糞便、SI、盲腸和結腸中分離出霍亂弧菌O1血清型N16961，隨後感染小鼠並測量了腸道霍亂弧菌的載量，隨後從不用的CL治療的小鼠中分離六種不同的普通芽孢桿菌進行RAPD分析，其中抗生素的治療實驗通過GF小鼠實現。隨後將GF小鼠轉移至等位基因區進行實驗分組，口服飼餵小鼠SM、VAN、CL和PBS，每天一次持續5天。隨後進行霍亂弧菌感染實驗，檢測糞便中的霍亂弧菌數。用霍亂弧菌野生型和缺失型菌株進行競爭指數測定，提取微生物的基因組並進行qPCR分析。繼而進行對小鼠盲腸進行代謝物提取，測得每種代謝物水平並應用專有軟件PeakStat進行層次聚類分析。結果表明在小鼠腸道中的擬桿菌科的主要物種為尋常型擬桿菌抑制霍亂弧菌（一種重要的人類病原體）的感染。克林黴素（CL）處理的小鼠腸道中擬桿菌被完全消除。當感染霍亂弧菌時，含有枯萎桿菌的成年小鼠會出現嚴重的霍亂樣症狀。尋常型擬桿菌單締合的無毒小鼠對霍亂弧菌感染具有抵抗力。CL處理後，包括短鏈脂肪酸在內的霍亂弧菌生長抑制代謝產物的水平下降，而霍亂弧菌增殖的化合物的水平則升高。本研究確定尋常型芽孢桿菌是一種可以抑制腸道感染的本地微生物，且提供了共生微生物和病原體入侵者如何在宿主腸道內相互作用的見解。
論文ID
原名：Commensal-derived metabolites govern Vibrio cholerae pathogenesis in host intestine
譯名：共生來源的代謝產物控制宿主腸道霍亂弧菌的發病機理
期刊：Microbiome
IF：10.465
發表時間：2019年9月
通訊作者：Sang Sun Yoon
通訊作者單位：延世大學醫學院，微生物與免疫學系
實驗設計
本研究首先從糞便、SI、盲腸和結腸中分離出霍亂弧菌O1血清型N16961，隨後感染小鼠並檢測了其腸道霍亂弧菌的載量，隨後從不用CL治療的小鼠中分離六種不同的普通芽孢桿菌進行RAPD分析，其中抗生素的治療實驗通過GF小鼠實現。隨後將GF小鼠轉移至等位基因區進行實驗分組，口服飼餵小鼠SM、VAN、CL和PBS，每天一次持續5天。隨後進行霍亂弧菌感染實驗，檢測糞便中的霍亂弧菌數。用霍亂弧菌野生型和缺失型菌株進行競爭指數測定，提取微生物的基因組並進行qPCR分析。繼而進行對小鼠盲腸進行代謝物提取，測得每種代謝物水平並應用專有軟件PeakStat進行層次聚類分析，評估了腸道微生物群的擾動對宿主感染霍亂弧菌的抵抗力。
結果
1 克林黴素治療的成年小鼠腸道菌群組成發生顯著變化，並易受霍亂弧菌感染的影響
腸道病原菌的定殖取決於宿主腸道內原生微生物的組成。為了觀察腸道菌群組成變化對多種實驗條件下宿主感染抵抗力的影響，採用三種具有獨特細菌殺傷模式的抗生素鏈黴素（SM），萬古黴素（VAN）和克林黴素（CL）處理了成年C57BL / 6無特定病原體（SPF）小鼠（8周齡）。SM是一種針對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌的廣譜抗生素。VAN是對抗革蘭氏陽性的有效抗生素，而已知CL可選擇性殺死厭氧菌。經過5天的每日處理後，收集小鼠糞便，通過16S rRNA基因測序分析微生物群組成。發現五個細菌門在各組之間具有特徵性分佈（圖1a–d）。在未經處理的對照組中，擬桿菌屬是最豐富的門，單個門的成員約佔整個微生物群的80％（圖1a）。經SM處理後，出現了疣微菌門，而擬桿菌門保持了主要的佔有率（圖1b）。VAN處理導致屬於疣微菌門和變形菌門細菌增殖，它們都是革蘭氏陰性菌（圖1c）。CL處理的結果是根除了擬桿菌門（Bacteroidetes），而沙門菌、厚壁菌門的數量基本保持不變（圖1d）。該觀察結果與以前的發現一致，即CL可有效治療脆弱的擬桿菌（Bacteroidetes phylum）的感染。另一方面，門氏桿菌在CL處理過程中經歷了爆炸性擴張，進一步證明CL不能有效抑制兼性厭氧菌的生長（圖1d）。
隨後，將每個抗生素組的小鼠感染霍亂弧菌第七大流行株N16961的5×108 CFU，以監測對感染的敏感性以及感染引起的微生物群組成的變化。在對照組和SM處理組中，霍亂弧菌感染後微生物群組成變化不大（圖1e，f）。響應N16961感染，VAN預處理組中擬桿菌的相對丰度增加（圖1g vs. c）。在經過CL處理的小鼠中，響應霍亂弧菌感染，厚壁菌門的相對丰度增加，而變形菌門的相對丰度降低（圖1h）。重要的是，在圖1h中檢測到的變形菌門中，發現約8.81％來源於霍亂弧菌特異性16S rRNA基因序列（圖3）。該結果值得特別關注，因為在其他組的變形桿菌種群中未檢測到霍亂弧菌特異性序列（圖1f，g）。
結果表明，霍亂弧菌可能在CL處理產生的條件下活躍地定殖在成年小鼠的腸道中。為了更深入地瞭解霍亂弧菌感染的結果，研究人員調查了從小腸到直腸的胃腸道是否引起了任何解剖學變化。在前三個實驗組中，小鼠組織看起來彼此相似，霍亂弧菌感染後未觀察到重大變化（圖1i-k）。相反，在CL治療組中，感染適應症的表型清楚地表明瞭以下適應症（圖1l）。首先，在小腸（紅色箭頭）中清楚地觀察到了積液。其次，盲腸的大小明顯小於其他組（黑色箭頭）。第三，結腸看起來更短、更逼真、變得透明，而其他組的結腸中充滿了糞便（結腸周圍的虛線）。第四，從CL處理組排出的糞便是高度水性的（數據未顯示）。總之，這些結果表明，當通過CL處理改變它們的腸道菌群組成時，霍亂弧菌感染會在成年小鼠中誘發霍亂樣症狀。
圖1 每個治療組中對抗生素治療和宿主對霍亂弧菌感染的微生物種群變化
2 採用不同方案的CL治療類似地誘發了霍亂弧菌感染的高敏感性
結果如圖1所示，表明通過簡單的抗生素預處理也可以在成年小鼠中誘發人霍亂患者中觀察到的水樣腹瀉症狀。在上述實驗中，每天用中度濃度的CL處理小鼠5天。為了闡明CL治療是否可以在較短的時間內引發類似的效果，實驗人員進行了另一組感染實驗，使用較高CL劑量的單次治療進行治療。類似於先前使用較低CL劑量的結果，在感染後24 h，在成年小鼠腸道中誘導了明顯的積液（FA）增加。FA比值確定為-0.176，比未感染組的值高1.6倍。與該發現一致，在CL預處理的小鼠中觀察到了強烈的霍亂弧菌定植。從小腸（SI）或盲腸中回收的霍亂弧菌細胞數量在CL治療組中明顯高於對照組。每克樣品分別在SI和盲腸中生長大於109 CFU的霍亂弧菌細胞。同樣，在從CL處理過的小鼠身上排出的糞便顆粒中也檢測到了109 CFU。相反，從對照組排出的糞便中根本沒有檢測到霍亂弧菌細胞。假定使用5×108 CFU的感染劑量，這些結果表明（i）霍亂弧菌細胞在普通成年小鼠的腸道內幾乎被完全消除，而（ii）相同數量的接種CL預處理的成年小鼠小腸細胞在霍亂弧菌中增殖更高。
3 移植有CL處理小鼠糞便的無胚小鼠易受霍亂弧菌感染
先前的研究表明，CL處理可以調節促炎性細胞因子的產生，特別是對脂多糖的反應。此外，亞致死濃度的CL體外刺激了針對金黃色葡萄球菌和擬桿菌屬的嗜中性白細胞吞噬作用。雖然上述的研究結果表明，CL誘導的腸道菌群組成的變化與霍亂弧菌感染的易感性增加有關，但這些先前的報道也表明成年小鼠霍亂弧菌感染力增強可能歸因於CL誘導的宿主調節免疫反應。為解決此問題，研究人員對無菌（GF）小鼠進行了糞便微生物群移植（FMT），並測試了具有重組腸道微生物群的GF小鼠是否對霍亂弧菌感染產生不同的耐藥性。從PBS或CL處理的小鼠中新鮮收集的糞便顆粒重懸於PBS中，並通過管飼法轉移到GF小鼠中。在為期3天的移植穩定期後，感染了5×108N16961細胞（圖2a）。移植有PBS處理的對照糞便顆粒的GF小鼠對感染具有較強的抵抗力。既不從所有六隻小鼠的SI中也不能從六隻小鼠中的五隻中分離出的盲腸中回收到霍亂弧菌（圖2b）。從移植的GF小鼠排出的糞便中檢測到不同程度的N16961細胞，每六隻小鼠中有四隻產生的糞便每克含有十個或更少的N16961細胞（圖2b）。相比之下，N16961定植在移植了CL處理並因此去除了擬桿菌的糞便的GF小鼠中更為活躍。在盲腸和糞便中，與對照組相比，分別觀察到細菌定植高出104倍和103.4倍（圖2b）。
接下來，檢測在霍亂弧菌定殖過程中，CT的產量（一種關鍵的毒力決定因素）是否相應增加。如圖2c所示，響應霍亂弧菌感染，在移植了經CL處理的小鼠的糞便懸浮液的小鼠中，CT產生顯著增加。由於從經CL處理的小鼠排出的糞便中殘留的CL很少，因此研究結果表明，通過CL處理誘導的腸道菌群組成發生變化，直接導致鼠宿主更容易受到霍亂弧菌感染。
圖2 用CL處理的小鼠的糞便移植的無胚小鼠易受霍亂弧菌感染
4 尋常桿菌是門生細菌中的主要物種，它在體內抑制霍亂弧菌的生長
根據圖1中顯示的結果，CL預處理小鼠中霍亂弧菌感染的升高可歸因於擬桿菌的消耗或擴展了變形菌門。同時，變形桿菌種群在經VAN處理的小鼠中同樣充分繁殖，該組小鼠未出現霍亂樣症狀（圖1c）。其次，在經過VAN處理的小鼠中，門生擬桿菌的相對丰度從38％（感染前）增加到61％（感染後）（圖1c，g）。基於這些結果，研究人員推測在VAN治療組中缺乏霍亂樣症狀的原因不僅是由於細菌門脈桿菌的存在，還歸因於感染引起的種群擴展。假設，主要佔據成年小鼠小腸的擬桿菌門在保護宿主免受霍亂弧菌感染方面起著關鍵作用。
為了深入瞭解哪些細菌物種是門生細菌的核心成員，使用16S rRNA基因測序進行了物種水平的種群分析。必要時，使用物種特異性引物對進行了PCR反應，並驗證了擴增產物的序列，確定了尋常桿菌、金細菌擬桿菌和卡卡擬桿菌三個不同的細菌物種屬於門生細菌。在對照小鼠中，發現尋常型芽孢桿菌存在量最大，相對丰度大於整個種群的50％（圖3）。作為對VAN處理的響應，金黃色葡萄球菌繁殖了，而普通芽孢桿菌的種群數量減少了。但是，值得注意的是，在霍亂弧菌感染後，尋常型B. vulgatus種群的相對丰度已恢復到原始水平。擬桿菌已從擬桿菌屬重新分類，從人腸分離的菌株對VAN處理有抗性。如圖1d所示，在霍亂弧菌感染之前或之後，從經CL處理的小鼠排出的糞便中未檢測到與這三種物種中的任何一種匹配的16S rRNA基因序列（圖3）。
因為在成人小鼠腸道中，普通雙歧桿菌是最主要的物種，所以接下來在更明確的條件下評估了普通雙歧桿菌對改變宿主對霍亂弧菌感染的敏感性的作用。為此，將厭氧芽孢桿菌細胞懸液與厭氧菌體外培養後單生GF小鼠（圖4a）。直接從小鼠糞便懸液培養的尋常型芽孢桿菌菌落經過RAPD分析，並且在分離的菌落之間觀察到相同的擴增模式，從而得出結論，大多數菌落是克隆的。如圖4a所示，在被霍亂弧菌細胞感染作為另外的陰性對照之前，GF小鼠還與熱滅活的普通雙歧桿菌單關聯。感染後24小時，與活的普通雙歧桿菌單聯的動物中回收的霍亂弧菌細胞數量明顯減少。與PBS對照組相比，在SI和結腸中，霍亂弧菌的定殖分別減少了約830倍和約40倍。同樣地，從移植有活性雙歧桿菌的GF小鼠的糞便中回收的霍亂弧菌細胞數比PBS對照低約75倍（圖4b）。重要的是，霍亂弧菌的定殖在與熱滅活的尋常性雙歧桿菌細胞單聯的動物中從未減少（圖4b）。這些結果表明，當存在於成年小鼠腸道中時，活躍的尋常性普通類桿菌細胞可以抑制霍亂弧菌的定殖。
接下來，研究人員探討了在已用於研究霍亂弧菌感染的幼鼠模型中，尋常型彎曲桿菌是否還能有效抑制霍亂弧菌定植。將五天大的幼鼠分為兩組，第一組移植有尋常小芽孢桿菌，另一組作為陰性對照（圖4c）。尋常型芽孢桿菌移植到幼鼠的腸中後，也可以有效抑制霍亂弧菌的定殖和體液積聚（圖4d）。在移植的尋常型雙歧桿菌存在下，霍亂弧菌的定殖減少了約4.47倍。儘管這兩組之間的差異沒有在成年小鼠實驗中所觀察到的明顯，但是霍亂弧菌的定殖和感染引起的體液積聚在移植了普通雙歧桿菌的幼鼠中均顯著降低了（圖4d）。
圖3 對抗生素治療和霍亂弧菌感染後物種水平的微生物群
圖4 普通類桿菌在體內抑制霍亂弧菌的生長
5 代謝組圖譜揭示了直接調節腸道霍亂弧菌生長的特徵代謝產物
接下來，實驗人員進行了代謝組分析，以檢查代謝組學譜圖是否響應CL治療和霍亂弧菌感染而改變。他們推測代謝產物水平的改變會影響宿主對霍亂弧菌感染的敏感性。如“方法”部分所述，對盲腸內容物進行CE-TOF / MS樣品製備。在研究者的分析中檢測到的代謝產物中，成功定量了273種代謝產物，它們在樣品之間的相對量顯示在熱圖中（圖5）。列出了列出四個樣品中所有273種代謝物及其相對量的表格，作為補充信息（一個補充excel文件）。在每一組的代謝組學譜之間的許多差異中，最引人注目的是，分別代表大量和少量化合物的紅線和綠線簇在對照組SPF與CL處理組中通常是相反的（第1欄與第2欄）。代謝組圖譜中的這種驚人變化可以解釋為微生物群組成發生了巨大變化的結果，如圖1所示。有趣的是，在兩個實驗組中，對霍亂弧菌感染的響應都觀察到了較小程度的圖譜變化（第1欄對比2和第3列對比4，圖5）。這些結果表明（1）CL治療比霍亂弧菌感染在代謝組譜上引起更多的實質性變化（2）CL誘導的代謝物水平變化可能創造了強烈促進霍亂弧菌生長和發病機理的環境。
表1列出了在對照SPF（化合物1-13）或經CL處理（化合物14-27）的小鼠中檢測到的最大代謝物列表。在SPF小鼠盲腸中檢測到的13種分子中，在CL處理的小鼠中未檢測到膽酸以外的所有分子。特別令人關注的是，（異）丁酸，丙酸和（異）戊酸（統稱為短鏈脂肪酸（SCFA））是對照組中檢測到最多的代謝物（表1）。選擇了14種相對量大於1.0E-03的化合物（14-27），並作為CL治療組的主要代謝產物（表1，底部）。在SPF對照組中，這些分子的相對量要麼是不可檢測的（化合物14、21、23和27），要麼是相當小的。這些結果進一步支持了這樣的觀點，即響應CL治療發生了明顯的輪廓變化。接下來，檢查了霍亂弧菌的生長是如何受這些主要化合物控制的。在列出的27種化合物中，根據可用性選擇了17種，監測了霍亂弧菌在補充有每種代謝物的M9培養基中的體外生長。進行圖6所示的生長曲線實驗以揭示可抑制霍亂弧菌生長的化合物。在這組特定的生長實驗中使用的M9培養基含有0.4％的葡萄糖作為主要碳源，從而使研究人員能夠監測外源添加的代謝產物是否促進或抑制霍亂弧菌的生長。K-Q組中顯示的7種代謝產物明顯抑制了霍亂弧菌的生長。重要的是，這些化合物在常規SPF小鼠腸道中的含量最高，但在CL處理過的小鼠腸道中則不存在或幾乎檢測不到（表1）。當培養基中包含NAG（圖6b）時，可以觀察到明顯的生長促進作用，NAG是在CL處理的小鼠中以足夠高的水平檢測到的代謝產物。補充尿素（圖6a）、葡糖二酸（圖6f）、腐胺（圖6i）或富馬酸（圖6j）會導致輕微的生長刺激，特別是在生長早期。再次，與SPF對照小鼠相比，在CL處理的小鼠中檢測到的這些代謝物含量更高（表1）。當在指示有代謝物作為唯一碳源的M9培養基中評估N16961的生長時，清楚地證明了每種代謝物刺激霍亂弧菌生長的能力（圖7）。與圖6b所示結果一致，NAG在刺激霍亂弧菌生長方面最有效，OD600值達到1.05（圖7b）。僅次於NAG、葡萄糖酸（圖7d）和葡萄糖酸內酯（圖7g）可有效促進霍亂弧菌的生長。正如預期的那樣，七種抑制性代謝產物（膽酸、丁酸、異丁酸、丙酸、戊酸、異戊酸和三甲胺）仍然阻止了霍亂弧菌的生長（圖7k-q）。總之，這些結果表明，CL誘導的宿主腸的變化清楚地反映在代謝物水平上，這種代謝組學特徵的重大改變顯著影響霍亂弧菌腸的生長。
CL處理的成年小鼠可以作為研究霍亂弧菌發病機理的模型。研究結果表明，在CL預處理的成年小鼠中可以清楚地觀察到感染誘導的表型，例如腸道菌落和液體積聚。因此，研究人員最終檢查了CL處理的小鼠是否可以用作描述霍亂弧菌感染的模型。為了解決這個問題，兩組小鼠感染了N16961及其ΔtcpA突變體的1：1混合物，該突變體是一種在腸道中定居缺陷的特徵明確的霍亂弧菌突變體。然後，通過計算競爭指數，比較了這兩個菌株的定殖能力。在這組特定的實驗中，CL處理的小鼠的體液積聚和細菌定植再次顯著增加，而PBS處理的對照組則沒有（其他文件3：圖S3）。對照組的六隻小鼠中有三隻完全消除了霍亂弧菌細胞（紅色箭頭線，圖8a）。重要的是，與WT N16961相比，ΔtcpA突變體表現出顯著降低的定殖能力（圖8b）。CL處理小鼠的小腸和盲腸的競爭指數（ΔtcpA/ WT）的平均值分別為0.29和0.28。相反，當使用未經處理的成年小鼠時，未檢測到兩個菌株之間定殖能力的有意義的差異（圖8b）。這些結果表明，CL預處理不僅誘導細菌活躍定殖，而且創造了寶貴的環境，並且可以利用它更好地瞭解霍亂弧菌的發病機理。
圖5 盲腸代謝物的層次聚類分析（HCA）構建的熱圖
圖6 所選代謝物對霍亂弧菌體外生長的抑制作用
圖7 選定代謝產物對霍亂弧菌體外刺激的影響
圖8 霍亂弧菌ΔtcpA突變體在CL處理的成年小鼠的腸道定植中存在缺陷
討論
霍亂研究中一個長期未解決的問題是霍亂弧菌是如何在自然界中進化為人類特異性病原體的。特別令人感興趣的是，GM1神經節苷脂（一種與CT結合的脂質分子）不僅存在於人腸上皮，而且還存在於小鼠腸上皮。這一觀點表明，CT是霍亂弧菌中最重要的毒力決定因素，在小鼠腸中也應活躍。但是，成年小鼠對霍亂弧菌感染具有天然抗性。研究人員假設了解人類和小鼠腸道菌群之間的成分差異將有助於解決宿主向性性這一重要問題。
16S rRNA基因測序數據（圖1和圖3）顯示，C57BL / 6小鼠腸道菌群中約80％屬於門生擬桿菌。實際上，完全消除CL處理誘導的門靜脈對於霍亂弧菌感染鼠宿主至關重要。但是，要使上述的發現與臨床相關，首先需要確定小鼠腸道微生物組在足夠程度上反映了人類腸道微生物組。先前的研究報道，在小鼠和人類腸道微生物區系中，擬桿菌門菌的相對丰度較高。此外，有證據表明，從人和其他動物宿主中分離到的普通雙歧桿菌基於它們的16S rRNA基因序列是無法區分的，這表明在小鼠和人腸的普通雙歧桿菌菌株之間的系統發育接近性。儘管如此，腸道微生物組的組成並不一定反映其功能。此外，即使小鼠腸道微生物組在門類水平上與人類的微生物組極為相似，相似性也在較低的分類學水平上消失，因為構成主要門脈桿菌的家庭和屬在小鼠和人之間有很大差異。為了彌補這種侷限性，實驗結果已經證明，當GF小鼠與尋常型芽孢桿菌單次結合並感染霍亂弧菌時，關鍵發現得以再現（圖4a，b）。考慮到這些因素，普通雙歧桿菌的相對丰度可能是霍亂弧菌感染力的重要決定因素，不僅在鼠類宿主中，而且在人類中。一個重要的問題將是在人的腸道中有多少與小鼠分離物共有相似功能的普通芽孢桿菌細胞。
根據物種水平的種群變化，大腸埃希氏菌在CL處理期間爆炸性增殖，併成為最主要的組成部分（圖3）。該發現表明在CL預處理的小鼠中對霍亂弧菌感染的易感性也可能是由於大量存在大腸桿菌細胞所致。與這一觀點相一致，發現具有強大過氧化氫酶活性的大腸桿菌菌株可刺激新生小鼠中霍亂弧菌腸道定植的增強。在相同的工作中，在接受VAN治療的成年小鼠中霍亂弧菌的定殖增加了。然而，在目前的研究中，在VAN治療組中未觀察到霍亂樣症狀，包括小腸積液和水樣糞便產生（圖1k）。因此，得出結論，對於宿主對霍亂弧菌感染的易感性，對於增加的大腸桿菌而言，普通類桿菌屬的丟失是更為關鍵的決定因素。
在本研究中，研究人員發現CL治療會增加正常抵抗力成年小鼠的霍亂弧菌感染性。先前的研究報道，抗生素的使用會觸發腸道菌群的營養不良，而這種干擾會導致宿主對各種腸道病原體感染的抵抗力受到抑制。由於CL處理導致腸道微生物組發生明顯擾動，因此可以想象該模型將顯示出對其他腸胃病原體（如腸炎沙門氏菌血清鼠傷寒桿菌、齧齒類檸檬酸桿菌和艱難梭菌）感染的敏感性增加。然而，對於上述腸病原體，已經存在一個成熟的成年小鼠模型。在這裡，研究人員建議一個簡單方便的動物模型來研究霍亂弧菌感染。口服CL治療的成年小鼠模型始終表現出霍亂樣症狀。在已經存在的用於霍亂研究的幾種動物模型中，乳鼠模型被認為是表現霍亂特徵性水樣腹瀉的描述性模型。但是，該模型不足以用於疫苗研究，因為哺乳小鼠尚未形成適應性免疫。此外，儘管這種想法尚未得到充分證實，但哺乳小鼠易受霍亂弧菌感染的影響可能是其免疫系統未成熟引起的偽影。因此，為了揭示霍亂弧菌在宿主腸中誘導霍亂所採用的病理生理機制，已經需要使用成年小鼠的感染模型。然而，在腸道菌群完整的成年小鼠中，霍亂弧菌的腸液分泌和連續定植並不容易發生。因此，已經提出了一種結紮的迴腸循環回模型，該模型涉及對動物腸道的外科手術。實驗中的CL誘導的成年小鼠模型可以通過簡單的治療方法建立，它清楚地再現了人類觀察到的典型霍亂症狀，例如嚴重的水瀉、大量積液和腸道粘液層中的霍亂弧菌定植。此外，在模型中，已經在腸液中檢測到CT，其水平足以引起腸液分泌（圖2c）。此外，ΔtcpA/ WT的競爭指數表明，TCP是一種經證實的人腸霍亂弧菌的定居因子，對於誘導成年小鼠的疾病也必不可少（圖8）。迄今為止，僅在乳兔和乳鼠中探索了TCP的重要性。
宿主來源的粘液聚糖是腸道菌群專門利用的營養來源。考慮到微生物對腸道營養資源的競爭以及聚糖通過上皮細胞週轉不斷釋放到管腔中，選擇微生物從營養上利用聚糖的能力為其生存和增殖提供了可以想象的優勢。大部分聚糖結構由N-乙酰氨基糖組成，例如N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）、N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc，NAG）和N-乙酰神經氨酸（Neu5Ac，NANA）。粘蛋白聚糖被配備糖苷酶基因的腸道微生物分解代謝產生了單糖。擬桿菌已進化為表達糖苷酶基因，使它們能夠進行粘蛋白降解至完全完成，因此變得非常適合在腸道中成長。屬於門生細菌和梭狀芽胞桿菌的厭氧菌通過糖酵解產生丙酮酸。在腸道缺氧的條件下，腸道微生物通過無氧分解代謝利用丙酮酸獲得額外的能量。厭氧發酵的主要終產物是短鏈脂肪酸（SCFA），例如丙酸、丁酸和戊酸。
在這項研究中，經CL處理的小鼠的盲腸代謝組的急劇變化與微生物群的組成變化密切相關。在用CL處理的小鼠的盲腸中，SCFA的耗竭和相對較高的氨基糖發生率表明，粘蛋白聚糖的分解代謝（一種屬於門生擬桿菌的微生物的繁殖策略）在CL處理後變得無活性。
宿主聚糖的利用對於霍亂弧菌侵入宿主腸道也很重要。當病原體進入腸道時，其增殖的下一個策略是定殖在覆蓋有粘液層的上皮細胞上。霍亂弧菌可有效響應粘液聚糖並分解代謝多糖，從而在宿主腸道中獲得競爭優勢。據報道，葡萄糖胺-6-磷酸酯（GlcNP-6）是GlcNAc和Neu5Ac分解代謝途徑之間共有的常見中間分子，對於霍亂弧菌的運動不可或缺。動力對營養源的趨化作用對霍亂弧菌的定殖和增殖很重要。與此概念一致，唾液酸（Neu5Ac）轉運蛋白（用VC1777-1779編碼）的耗竭可減弱定植。在此過程中，霍亂弧菌需要克服許多挑戰，例如酸脅迫、抗菌肽、宿主免疫反應和SCFA。腹瀉患者腸內SCFA的減少和常規治療後SCFA水平的恢復支持了SCFA可能是腸微生物群普遍存在的一個因素。總的來說，SCFA被認為是抵抗病原體入侵的有效屏障，儘管一些腸道病原體利用SCFA來感知周圍環境並決定是否表達其毒力因子。
圖9 CL誘導的微生物組成變化及其對宿主對霍亂弧菌感染易感性的影響。
結果表明，N-乙酰氨基糖的分解代謝和隨後SCFA在遠端腸中的積累在很大程度上由特定的腸道菌群控制（圖3）。如圖9所示，消除CL處理所引起的厭氧細菌和梭菌屬會導致腸道代謝產物的急劇變化，尤其是主要由細菌和梭菌產生的丙酸和丁酸在CL處理後會顯著減少，因此多種代謝產物（NAG，NANA，葡萄糖酸鹽，葡萄糖酸內酯等）。研究結果表明，N-乙酰氨基糖的分解代謝和隨後SCFA在遠端小腸的積累主要由特定的腸道菌群控制（圖3）。如圖9所示，消除CL處理所引起的厭氧細菌和梭菌屬會導致腸道代謝產物的急劇變化，尤其是主要由細菌和梭菌產生的丙酸和丁酸在CL處理後會顯著減少，在腸道環境受干擾的情況下，霍亂弧菌很容易獲得營養來源，因為它與降解宿主聚糖並因此與產生SCFA的腸道菌群（主要是擬桿菌和梭狀芽胞桿菌）沒有競爭。
結論
總而言之，研究人員確定了一種共生細菌，即尋常型外陰擬桿菌，它在抑制成年小鼠小腸霍亂弧菌的定殖中起著重要作用。此外，研究人員提出了一種簡單的抗生素治療小鼠模型來描述霍亂弧菌感染，這可能被證明是霍亂疫苗研究的有用工具。本研究中提出的結果將有望刺激未來的研究，以更好地瞭解普通雙歧桿菌對霍亂弧菌感染的體內益生菌功能，並設計出更好的策略來解決這種有毒和臨床意義的人類病原體。
閱讀更多 營養醫學 的文章
