原创 Jione、song 微生态 2019-10-06
导读
霍乱弧菌是流行性腹泻霍乱的病原体，已有报道显示霍乱毒素（CT）和毒素致密菌毛（TCP）是主要的毒力决定因素，而且其致病机制为与土著微生物相互作用有关。而肠道微生物群的一个关键的特点是其对肠致病菌的感染的保护能力，称为“抗菌能力”。肠道内微生物物种互作的内在因素是群落组成，包括细菌间的竞争和抗菌物质的分泌；而外源因素包括炎症、饮食和抗生素治疗。但肠道微生物群的扰动如何损害宿主对感染病原体的抵抗力尚不明确，尤其表现在通过物种和代谢产物水平的变化。本研究从粪便、SI、盲肠和结肠中分离出霍乱弧菌O1血清型N16961，随后感染小鼠并测量了肠道霍乱弧菌的载量，随后从不用的CL治疗的小鼠中分离六种不同的普通芽孢杆菌进行RAPD分析，其中抗生素的治疗实验通过GF小鼠实现。随后将GF小鼠转移至等位基因区进行实验分组，口服饲喂小鼠SM、VAN、CL和PBS，每天一次持续5天。随后进行霍乱弧菌感染实验，检测粪便中的霍乱弧菌数。用霍乱弧菌野生型和缺失型菌株进行竞争指数测定，提取微生物的基因组并进行qPCR分析。继而进行对小鼠盲肠进行代谢物提取，测得每种代谢物水平并应用专有软件PeakStat进行层次聚类分析。结果表明在小鼠肠道中的拟杆菌科的主要物种为寻常型拟杆菌抑制霍乱弧菌（一种重要的人类病原体）的感染。克林霉素（CL）处理的小鼠肠道中拟杆菌被完全消除。当感染霍乱弧菌时，含有枯萎杆菌的成年小鼠会出现严重的霍乱样症状。寻常型拟杆菌单缔合的无毒小鼠对霍乱弧菌感染具有抵抗力。CL处理后，包括短链脂肪酸在内的霍乱弧菌生长抑制代谢产物的水平下降，而霍乱弧菌增殖的化合物的水平则升高。本研究确定寻常型芽孢杆菌是一种可以抑制肠道感染的本地微生物，且提供了共生微生物和病原体入侵者如何在宿主肠道内相互作用的见解。
论文ID
原名：Commensal-derived metabolites govern Vibrio cholerae pathogenesis in host intestine
译名：共生来源的代谢产物控制宿主肠道霍乱弧菌的发病机理
期刊：Microbiome
IF：10.465
发表时间：2019年9月
通讯作者：Sang Sun Yoon
通讯作者单位：延世大学医学院，微生物与免疫学系
实验设计
本研究首先从粪便、SI、盲肠和结肠中分离出霍乱弧菌O1血清型N16961，随后感染小鼠并检测了其肠道霍乱弧菌的载量，随后从不用CL治疗的小鼠中分离六种不同的普通芽孢杆菌进行RAPD分析，其中抗生素的治疗实验通过GF小鼠实现。随后将GF小鼠转移至等位基因区进行实验分组，口服饲喂小鼠SM、VAN、CL和PBS，每天一次持续5天。随后进行霍乱弧菌感染实验，检测粪便中的霍乱弧菌数。用霍乱弧菌野生型和缺失型菌株进行竞争指数测定，提取微生物的基因组并进行qPCR分析。继而进行对小鼠盲肠进行代谢物提取，测得每种代谢物水平并应用专有软件PeakStat进行层次聚类分析，评估了肠道微生物群的扰动对宿主感染霍乱弧菌的抵抗力。
结果
1 克林霉素治疗的成年小鼠肠道菌群组成发生显着变化，并易受霍乱弧菌感染的影响
肠道病原菌的定殖取决于宿主肠道内原生微生物的组成。为了观察肠道菌群组成变化对多种实验条件下宿主感染抵抗力的影响，采用三种具有独特细菌杀伤模式的抗生素链霉素（SM），万古霉素（VAN）和克林霉素（CL）处理了成年C57BL / 6无特定病原体（SPF）小鼠（8周龄）。SM是一种针对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的广谱抗生素。VAN是对抗革兰氏阳性的有效抗生素，而已知CL可选择性杀死厌氧菌。经过5天的每日处理后，收集小鼠粪便，通过16S rRNA基因测序分析微生物群组成。发现五个细菌门在各组之间具有特征性分布（图1a–d）。在未经处理的对照组中，拟杆菌属是最丰富的门，单个门的成员约占整个微生物群的80％（图1a）。经SM处理后，出现了疣微菌门，而拟杆菌门保持了主要的占有率（图1b）。VAN处理导致属于疣微菌门和变形菌门细菌增殖，它们都是革兰氏阴性菌（图1c）。CL处理的结果是根除了拟杆菌门（Bacteroidetes），而沙门菌、厚壁菌门的数量基本保持不变（图1d）。该观察结果与以前的发现一致，即CL可有效治疗脆弱的拟杆菌（Bacteroidetes phylum）的感染。另一方面，门氏杆菌在CL处理过程中经历了爆炸性扩张，进一步证明CL不能有效抑制兼性厌氧菌的生长（图1d）。
随后，将每个抗生素组的小鼠感染霍乱弧菌第七大流行株N16961的5×108 CFU，以监测对感染的敏感性以及感染引起的微生物群组成的变化。在对照组和SM处理组中，霍乱弧菌感染后微生物群组成变化不大（图1e，f）。响应N16961感染，VAN预处理组中拟杆菌的相对丰度增加（图1g vs. c）。在经过CL处理的小鼠中，响应霍乱弧菌感染，厚壁菌门的相对丰度增加，而变形菌门的相对丰度降低（图1h）。重要的是，在图1h中检测到的变形菌门中，发现约8.81％来源于霍乱弧菌特异性16S rRNA基因序列（图3）。该结果值得特别关注，因为在其他组的变形杆菌种群中未检测到霍乱弧菌特异性序列（图1f，g）。
结果表明，霍乱弧菌可能在CL处理产生的条件下活跃地定殖在成年小鼠的肠道中。为了更深入地了解霍乱弧菌感染的结果，研究人员调查了从小肠到直肠的胃肠道是否引起了任何解剖学变化。在前三个实验组中，小鼠组织看起来彼此相似，霍乱弧菌感染后未观察到重大变化（图1i-k）。相反，在CL治疗组中，感染适应症的表型清楚地表明了以下适应症（图1l）。首先，在小肠（红色箭头）中清楚地观察到了积液。其次，盲肠的大小明显小于其他组（黑色箭头）。第三，结肠看起来更短、更逼真、变得透明，而其他组的结肠中充满了粪便（结肠周围的虚线）。第四，从CL处理组排出的粪便是高度水性的（数据未显示）。总之，这些结果表明，当通过CL处理改变它们的肠道菌群组成时，霍乱弧菌感染会在成年小鼠中诱发霍乱样症状。
图1 每个治疗组中对抗生素治疗和宿主对霍乱弧菌感染的微生物种群变化
2 采用不同方案的CL治疗类似地诱发了霍乱弧菌感染的高敏感性
结果如图1所示，表明通过简单的抗生素预处理也可以在成年小鼠中诱发人霍乱患者中观察到的水样腹泻症状。在上述实验中，每天用中度浓度的CL处理小鼠5天。为了阐明CL治疗是否可以在较短的时间内引发类似的效果，实验人员进行了另一组感染实验，使用较高CL剂量的单次治疗进行治疗。类似于先前使用较低CL剂量的结果，在感染后24 h，在成年小鼠肠道中诱导了明显的积液（FA）增加。FA比值确定为-0.176，比未感染组的值高1.6倍。与该发现一致，在CL预处理的小鼠中观察到了强烈的霍乱弧菌定植。从小肠（SI）或盲肠中回收的霍乱弧菌细胞数量在CL治疗组中明显高于对照组。每克样品分别在SI和盲肠中生长大于109 CFU的霍乱弧菌细胞。同样，在从CL处理过的小鼠身上排出的粪便颗粒中也检测到了109 CFU。相反，从对照组排出的粪便中根本没有检测到霍乱弧菌细胞。假定使用5×108 CFU的感染剂量，这些结果表明（i）霍乱弧菌细胞在普通成年小鼠的肠道内几乎被完全消除，而（ii）相同数量的接种CL预处理的成年小鼠小肠细胞在霍乱弧菌中增殖更高。
3 移植有CL处理小鼠粪便的无胚小鼠易受霍乱弧菌感染
先前的研究表明，CL处理可以调节促炎性细胞因子的产生，特别是对脂多糖的反应。此外，亚致死浓度的CL体外刺激了针对金黄色葡萄球菌和拟杆菌属的嗜中性白细胞吞噬作用。虽然上述的研究结果表明，CL诱导的肠道菌群组成的变化与霍乱弧菌感染的易感性增加有关，但这些先前的报道也表明成年小鼠霍乱弧菌感染力增强可能归因于CL诱导的宿主调节免疫反应。为解决此问题，研究人员对无菌（GF）小鼠进行了粪便微生物群移植（FMT），并测试了具有重组肠道微生物群的GF小鼠是否对霍乱弧菌感染产生不同的耐药性。从PBS或CL处理的小鼠中新鲜收集的粪便颗粒重悬于PBS中，并通过管饲法转移到GF小鼠中。在为期3天的移植稳定期后，感染了5×108N16961细胞（图2a）。移植有PBS处理的对照粪便颗粒的GF小鼠对感染具有较强的抵抗力。既不从所有六只小鼠的SI中也不能从六只小鼠中的五只中分离出的盲肠中回收到霍乱弧菌（图2b）。从移植的GF小鼠排出的粪便中检测到不同程度的N16961细胞，每六只小鼠中有四只产生的粪便每克含有十个或更少的N16961细胞（图2b）。相比之下，N16961定植在移植了CL处理并因此去除了拟杆菌的粪便的GF小鼠中更为活跃。在盲肠和粪便中，与对照组相比，分别观察到细菌定植高出104倍和103.4倍（图2b）。
接下来，检测在霍乱弧菌定殖过程中，CT的产量（一种关键的毒力决定因素）是否相应增加。如图2c所示，响应霍乱弧菌感染，在移植了经CL处理的小鼠的粪便悬浮液的小鼠中，CT产生显着增加。由于从经CL处理的小鼠排出的粪便中残留的CL很少，因此研究结果表明，通过CL处理诱导的肠道菌群组成发生变化，直接导致鼠宿主更容易受到霍乱弧菌感染。
图2 用CL处理的小鼠的粪便移植的无胚小鼠易受霍乱弧菌感染
4 寻常杆菌是门生细菌中的主要物种，它在体内抑制霍乱弧菌的生长
根据图1中显示的结果，CL预处理小鼠中霍乱弧菌感染的升高可归因于拟杆菌的消耗或扩展了变形菌门。同时，变形杆菌种群在经VAN处理的小鼠中同样充分繁殖，该组小鼠未出现霍乱样症状（图1c）。其次，在经过VAN处理的小鼠中，门生拟杆菌的相对丰度从38％（感染前）增加到61％（感染后）（图1c，g）。基于这些结果，研究人员推测在VAN治疗组中缺乏霍乱样症状的原因不仅是由于细菌门脉杆菌的存在，还归因于感染引起的种群扩展。假设，主要占据成年小鼠小肠的拟杆菌门在保护宿主免受霍乱弧菌感染方面起着关键作用。
为了深入了解哪些细菌物种是门生细菌的核心成员，使用16S rRNA基因测序进行了物种水平的种群分析。必要时，使用物种特异性引物对进行了PCR反应，并验证了扩增产物的序列，确定了寻常杆菌、金细菌拟杆菌和卡卡拟杆菌三个不同的细菌物种属于门生细菌。在对照小鼠中，发现寻常型芽孢杆菌存在量最大，相对丰度大于整个种群的50％（图3）。作为对VAN处理的响应，金黄色葡萄球菌繁殖了，而普通芽孢杆菌的种群数量减少了。但是，值得注意的是，在霍乱弧菌感染后，寻常型B. vulgatus种群的相对丰度已恢复到原始水平。拟杆菌已从拟杆菌属重新分类，从人肠分离的菌株对VAN处理有抗性。如图1d所示，在霍乱弧菌感染之前或之后，从经CL处理的小鼠排出的粪便中未检测到与这三种物种中的任何一种匹配的16S rRNA基因序列（图3）。
因为在成人小鼠肠道中，普通双歧杆菌是最主要的物种，所以接下来在更明确的条件下评估了普通双歧杆菌对改变宿主对霍乱弧菌感染的敏感性的作用。为此，将厌氧芽孢杆菌细胞悬液与厌氧菌体外培养后单生GF小鼠（图4a）。直接从小鼠粪便悬液培养的寻常型芽孢杆菌菌落经过RAPD分析，并且在分离的菌落之间观察到相同的扩增模式，从而得出结论，大多数菌落是克隆的。如图4a所示，在被霍乱弧菌细胞感染作为另外的阴性对照之前，GF小鼠还与热灭活的普通双歧杆菌单关联。感染后24小时，与活的普通双歧杆菌单联的动物中回收的霍乱弧菌细胞数量明显减少。与PBS对照组相比，在SI和结肠中，霍乱弧菌的定殖分别减少了约830倍和约40倍。同样地，从移植有活性双歧杆菌的GF小鼠的粪便中回收的霍乱弧菌细胞数比PBS对照低约75倍（图4b）。重要的是，霍乱弧菌的定殖在与热灭活的寻常性双歧杆菌细胞单联的动物中从未减少（图4b）。这些结果表明，当存在于成年小鼠肠道中时，活跃的寻常性普通类杆菌细胞可以抑制霍乱弧菌的定殖。
接下来，研究人员探讨了在已用于研究霍乱弧菌感染的幼鼠模型中，寻常型弯曲杆菌是否还能有效抑制霍乱弧菌定植。将五天大的幼鼠分为两组，第一组移植有寻常小芽孢杆菌，另一组作为阴性对照（图4c）。寻常型芽孢杆菌移植到幼鼠的肠中后，也可以有效抑制霍乱弧菌的定殖和体液积聚（图4d）。在移植的寻常型双歧杆菌存在下，霍乱弧菌的定殖减少了约4.47倍。尽管这两组之间的差异没有在成年小鼠实验中所观察到的明显，但是霍乱弧菌的定殖和感染引起的体液积聚在移植了普通双歧杆菌的幼鼠中均显着降低了（图4d）。
图3 对抗生素治疗和霍乱弧菌感染后物种水平的微生物群
图4 普通类杆菌在体内抑制霍乱弧菌的生长
5 代谢组图谱揭示了直接调节肠道霍乱弧菌生长的特征代谢产物
接下来，实验人员进行了代谢组分析，以检查代谢组学谱图是否响应CL治疗和霍乱弧菌感染而改变。他们推测代谢产物水平的改变会影响宿主对霍乱弧菌感染的敏感性。如“方法”部分所述，对盲肠内容物进行CE-TOF / MS样品制备。在研究者的分析中检测到的代谢产物中，成功定量了273种代谢产物，它们在样品之间的相对量显示在热图中（图5）。列出了列出四个样品中所有273种代谢物及其相对量的表格，作为补充信息（一个补充excel文件）。在每一组的代谢组学谱之间的许多差异中，最引人注目的是，分别代表大量和少量化合物的红线和绿线簇在对照组SPF与CL处理组中通常是相反的（第1栏与第2栏）。代谢组图谱中的这种惊人变化可以解释为微生物群组成发生了巨大变化的结果，如图1所示。有趣的是，在两个实验组中，对霍乱弧菌感染的响应都观察到了较小程度的图谱变化（第1栏对比2和第3列对比4，图5）。这些结果表明（1）CL治疗比霍乱弧菌感染在代谢组谱上引起更多的实质性变化（2）CL诱导的代谢物水平变化可能创造了强烈促进霍乱弧菌生长和发病机理的环境。
表1列出了在对照SPF（化合物1-13）或经CL处理（化合物14-27）的小鼠中检测到的最大代谢物列表。在SPF小鼠盲肠中检测到的13种分子中，在CL处理的小鼠中未检测到胆酸以外的所有分子。特别令人关注的是，（异）丁酸，丙酸和（异）戊酸（统称为短链脂肪酸（SCFA））是对照组中检测到最多的代谢物（表1）。选择了14种相对量大于1.0E-03的化合物（14-27），并作为CL治疗组的主要代谢产物（表1，底部）。在SPF对照组中，这些分子的相对量要么是不可检测的（化合物14、21、23和27），要么是相当小的。这些结果进一步支持了这样的观点，即响应CL治疗发生了明显的轮廓变化。接下来，检查了霍乱弧菌的生长是如何受这些主要化合物控制的。在列出的27种化合物中，根据可用性选择了17种，监测了霍乱弧菌在补充有每种代谢物的M9培养基中的体外生长。进行图6所示的生长曲线实验以揭示可抑制霍乱弧菌生长的化合物。在这组特定的生长实验中使用的M9培养基含有0.4％的葡萄糖作为主要碳源，从而使研究人员能够监测外源添加的代谢产物是否促进或抑制霍乱弧菌的生长。K-Q组中显示的7种代谢产物明显抑制了霍乱弧菌的生长。重要的是，这些化合物在常规SPF小鼠肠道中的含量最高，但在CL处理过的小鼠肠道中则不存在或几乎检测不到（表1）。当培养基中包含NAG（图6b）时，可以观察到明显的生长促进作用，NAG是在CL处理的小鼠中以足够高的水平检测到的代谢产物。补充尿素（图6a）、葡糖二酸（图6f）、腐胺（图6i）或富马酸（图6j）会导致轻微的生长刺激，特别是在生长早期。再次，与SPF对照小鼠相比，在CL处理的小鼠中检测到的这些代谢物含量更高（表1）。当在指示有代谢物作为唯一碳源的M9培养基中评估N16961的生长时，清楚地证明了每种代谢物刺激霍乱弧菌生长的能力（图7）。与图6b所示结果一致，NAG在刺激霍乱弧菌生长方面最有效，OD600值达到1.05（图7b）。仅次于NAG、葡萄糖酸（图7d）和葡萄糖酸内酯（图7g）可有效促进霍乱弧菌的生长。正如预期的那样，七种抑制性代谢产物（胆酸、丁酸、异丁酸、丙酸、戊酸、异戊酸和三甲胺）仍然阻止了霍乱弧菌的生长（图7k-q）。总之，这些结果表明，CL诱导的宿主肠的变化清楚地反映在代谢物水平上，这种代谢组学特征的重大改变显着影响霍乱弧菌肠的生长。
CL处理的成年小鼠可以作为研究霍乱弧菌发病机理的模型。研究结果表明，在CL预处理的成年小鼠中可以清楚地观察到感染诱导的表型，例如肠道菌落和液体积聚。因此，研究人员最终检查了CL处理的小鼠是否可以用作描述霍乱弧菌感染的模型。为了解决这个问题，两组小鼠感染了N16961及其ΔtcpA突变体的1：1混合物，该突变体是一种在肠道中定居缺陷的特征明确的霍乱弧菌突变体。然后，通过计算竞争指数，比较了这两个菌株的定殖能力。在这组特定的实验中，CL处理的小鼠的体液积聚和细菌定植再次显着增加，而PBS处理的对照组则没有（其他文件3：图S3）。对照组的六只小鼠中有三只完全消除了霍乱弧菌细胞（红色箭头线，图8a）。重要的是，与WT N16961相比，ΔtcpA突变体表现出显着降低的定殖能力（图8b）。CL处理小鼠的小肠和盲肠的竞争指数（ΔtcpA/ WT）的平均值分别为0.29和0.28。相反，当使用未经处理的成年小鼠时，未检测到两个菌株之间定殖能力的有意义的差异（图8b）。这些结果表明，CL预处理不仅诱导细菌活跃定殖，而且创造了宝贵的环境，并且可以利用它更好地了解霍乱弧菌的发病机理。
图5 盲肠代谢物的层次聚类分析（HCA）构建的热图
图6 所选代谢物对霍乱弧菌体外生长的抑制作用
图7 选定代谢产物对霍乱弧菌体外刺激的影响
图8 霍乱弧菌ΔtcpA突变体在CL处理的成年小鼠的肠道定植中存在缺陷
讨论
霍乱研究中一个长期未解决的问题是霍乱弧菌是如何在自然界中进化为人类特异性病原体的。特别令人感兴趣的是，GM1神经节苷脂（一种与CT结合的脂质分子）不仅存在于人肠上皮，而且还存在于小鼠肠上皮。这一观点表明，CT是霍乱弧菌中最重要的毒力决定因素，在小鼠肠中也应活跃。但是，成年小鼠对霍乱弧菌感染具有天然抗性。研究人员假设了解人类和小鼠肠道菌群之间的成分差异将有助于解决宿主向性性这一重要问题。
16S rRNA基因测序数据（图1和图3）显示，C57BL / 6小鼠肠道菌群中约80％属于门生拟杆菌。实际上，完全消除CL处理诱导的门静脉对于霍乱弧菌感染鼠宿主至关重要。但是，要使上述的发现与临床相关，首先需要确定小鼠肠道微生物组在足够程度上反映了人类肠道微生物组。先前的研究报道，在小鼠和人类肠道微生物区系中，拟杆菌门菌的相对丰度较高。此外，有证据表明，从人和其他动物宿主中分离到的普通双歧杆菌基于它们的16S rRNA基因序列是无法区分的，这表明在小鼠和人肠的普通双歧杆菌菌株之间的系统发育接近性。尽管如此，肠道微生物组的组成并不一定反映其功能。此外，即使小鼠肠道微生物组在门类水平上与人类的微生物组极为相似，相似性也在较低的分类学水平上消失，因为构成主要门脉杆菌的家庭和属在小鼠和人之间有很大差异。为了弥补这种局限性，实验结果已经证明，当GF小鼠与寻常型芽孢杆菌单次结合并感染霍乱弧菌时，关键发现得以再现（图4a，b）。考虑到这些因素，普通双歧杆菌的相对丰度可能是霍乱弧菌感染力的重要决定因素，不仅在鼠类宿主中，而且在人类中。一个重要的问题将是在人的肠道中有多少与小鼠分离物共有相似功能的普通芽孢杆菌细胞。
根据物种水平的种群变化，大肠埃希氏菌在CL处理期间爆炸性增殖，并成为最主要的组成部分（图3）。该发现表明在CL预处理的小鼠中对霍乱弧菌感染的易感性也可能是由于大量存在大肠杆菌细胞所致。与这一观点相一致，发现具有强大过氧化氢酶活性的大肠杆菌菌株可刺激新生小鼠中霍乱弧菌肠道定植的增强。在相同的工作中，在接受VAN治疗的成年小鼠中霍乱弧菌的定殖增加了。然而，在目前的研究中，在VAN治疗组中未观察到霍乱样症状，包括小肠积液和水样粪便产生（图1k）。因此，得出结论，对于宿主对霍乱弧菌感染的易感性，对于增加的大肠杆菌而言，普通类杆菌属的丢失是更为关键的决定因素。
在本研究中，研究人员发现CL治疗会增加正常抵抗力成年小鼠的霍乱弧菌感染性。先前的研究报道，抗生素的使用会触发肠道菌群的营养不良，而这种干扰会导致宿主对各种肠道病原体感染的抵抗力受到抑制。由于CL处理导致肠道微生物组发生明显扰动，因此可以想象该模型将显示出对其他肠胃病原体（如肠炎沙门氏菌血清鼠伤寒杆菌、啮齿类柠檬酸杆菌和艰难梭菌）感染的敏感性增加。然而，对于上述肠病原体，已经存在一个成熟的成年小鼠模型。在这里，研究人员建议一个简单方便的动物模型来研究霍乱弧菌感染。口服CL治疗的成年小鼠模型始终表现出霍乱样症状。在已经存在的用于霍乱研究的几种动物模型中，乳鼠模型被认为是表现霍乱特征性水样腹泻的描述性模型。但是，该模型不足以用于疫苗研究，因为哺乳小鼠尚未形成适应性免疫。此外，尽管这种想法尚未得到充分证实，但哺乳小鼠易受霍乱弧菌感染的影响可能是其免疫系统未成熟引起的伪影。因此，为了揭示霍乱弧菌在宿主肠中诱导霍乱所采用的病理生理机制，已经需要使用成年小鼠的感染模型。然而，在肠道菌群完整的成年小鼠中，霍乱弧菌的肠液分泌和连续定植并不容易发生。因此，已经提出了一种结扎的回肠循环回模型，该模型涉及对动物肠道的外科手术。实验中的CL诱导的成年小鼠模型可以通过简单的治疗方法建立，它清楚地再现了人类观察到的典型霍乱症状，例如严重的水泻、大量积液和肠道粘液层中的霍乱弧菌定植。此外，在模型中，已经在肠液中检测到CT，其水平足以引起肠液分泌（图2c）。此外，ΔtcpA/ WT的竞争指数表明，TCP是一种经证实的人肠霍乱弧菌的定居因子，对于诱导成年小鼠的疾病也必不可少（图8）。迄今为止，仅在乳兔和乳鼠中探索了TCP的重要性。
宿主来源的粘液聚糖是肠道菌群专门利用的营养来源。考虑到微生物对肠道营养资源的竞争以及聚糖通过上皮细胞周转不断释放到管腔中，选择微生物从营养上利用聚糖的能力为其生存和增殖提供了可以想象的优势。大部分聚糖结构由N-乙酰氨基糖组成，例如N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）、N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc，NAG）和N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac，NANA）。粘蛋白聚糖被配备糖苷酶基因的肠道微生物分解代谢产生了单糖。拟杆菌已进化为表达糖苷酶基因，使它们能够进行粘蛋白降解至完全完成，因此变得非常适合在肠道中成长。属于门生细菌和梭状芽胞杆菌的厌氧菌通过糖酵解产生丙酮酸。在肠道缺氧的条件下，肠道微生物通过无氧分解代谢利用丙酮酸获得额外的能量。厌氧发酵的主要终产物是短链脂肪酸（SCFA），例如丙酸、丁酸和戊酸。
在这项研究中，经CL处理的小鼠的盲肠代谢组的急剧变化与微生物群的组成变化密切相关。在用CL处理的小鼠的盲肠中，SCFA的耗竭和相对较高的氨基糖发生率表明，粘蛋白聚糖的分解代谢（一种属于门生拟杆菌的微生物的繁殖策略）在CL处理后变得无活性。
宿主聚糖的利用对于霍乱弧菌侵入宿主肠道也很重要。当病原体进入肠道时，其增殖的下一个策略是定殖在覆盖有粘液层的上皮细胞上。霍乱弧菌可有效响应粘液聚糖并分解代谢多糖，从而在宿主肠道中获得竞争优势。据报道，葡萄糖胺-6-磷酸酯（GlcNP-6）是GlcNAc和Neu5Ac分解代谢途径之间共有的常见中间分子，对于霍乱弧菌的运动不可或缺。动力对营养源的趋化作用对霍乱弧菌的定殖和增殖很重要。与此概念一致，唾液酸（Neu5Ac）转运蛋白（用VC1777-1779编码）的耗竭可减弱定植。在此过程中，霍乱弧菌需要克服许多挑战，例如酸胁迫、抗菌肽、宿主免疫反应和SCFA。腹泻患者肠内SCFA的减少和常规治疗后SCFA水平的恢复支持了SCFA可能是肠微生物群普遍存在的一个因素。总的来说，SCFA被认为是抵抗病原体入侵的有效屏障，尽管一些肠道病原体利用SCFA来感知周围环境并决定是否表达其毒力因子。
图9 CL诱导的微生物组成变化及其对宿主对霍乱弧菌感染易感性的影响。
结果表明，N-乙酰氨基糖的分解代谢和随后SCFA在远端肠中的积累在很大程度上由特定的肠道菌群控制（图3）。如图9所示，消除CL处理所引起的厌氧细菌和梭菌属会导致肠道代谢产物的急剧变化，尤其是主要由细菌和梭菌产生的丙酸和丁酸在CL处理后会显着减少，因此多种代谢产物（NAG，NANA，葡萄糖酸盐，葡萄糖酸内酯等）。研究结果表明，N-乙酰氨基糖的分解代谢和随后SCFA在远端小肠的积累主要由特定的肠道菌群控制（图3）。如图9所示，消除CL处理所引起的厌氧细菌和梭菌属会导致肠道代谢产物的急剧变化，尤其是主要由细菌和梭菌产生的丙酸和丁酸在CL处理后会显着减少，在肠道环境受干扰的情况下，霍乱弧菌很容易获得营养来源，因为它与降解宿主聚糖并因此与产生SCFA的肠道菌群（主要是拟杆菌和梭状芽胞杆菌）没有竞争。
结论
总而言之，研究人员确定了一种共生细菌，即寻常型外阴拟杆菌，它在抑制成年小鼠小肠霍乱弧菌的定殖中起着重要作用。此外，研究人员提出了一种简单的抗生素治疗小鼠模型来描述霍乱弧菌感染，这可能被证明是霍乱疫苗研究的有用工具。本研究中提出的结果将有望刺激未来的研究，以更好地了解普通双歧杆菌对霍乱弧菌感染的体内益生菌功能，并设计出更好的策略来解决这种有毒和临床意义的人类病原体。
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