DNA轉錄調控功能障礙通常與人類疾病有關。為了解轉錄調控，科學家已經開發了全基因組測序方法來分析RNA聚合酶（Pol II ChIP-seq）或檢測新生RNA水平。其中，新生RNA檢測方法通常包括連續檢測、Pol II相關或染色質相關的RNA富集。但以上這些方法仍存在一定的侷限性。例如ChIP-seq方法無法區分RNA聚合酶是簡單結合還是積極參與轉錄。Pol-II相關RNA富集方法通常需要數百萬個細胞作為起始材料。其他方法可能無法準確地測量瞬時和低丰度RNA。
此外，大多數RNA會經過轉錄後處理，以上方法檢測的是RNA的間接水平，可能無法準確反映原位轉錄動態。科學家認為，由於參與轉錄的RNA聚合酶可分解DNA的雙螺旋併產生“單鏈DNA氣泡”，如果在整個基因組中定位單鏈DNA（ssDNA）可提供參與轉錄的RNA聚合酶活性和動力學信息。
近日，芝加哥大學何川研究團隊開發了一種新的單鏈DNA測序（KAS-seq）方法。KAS-seq可在全基因組範圍內快速、敏感地檢測和定位由轉錄或其他過程產生的ssDNA，且只需使用1000個細胞即可實現。4月6日，該研究成果在Nature Methods上發表，文章題為“Kethoxal-assisted single-stranded DNA sequencing captures global transcription dynamics and enhancer activities in situ”。
該方法基於N3-kethoxal和鳥嘌呤在ssDNA中快速而特異性的反應開發。N3-kethoxal分子能夠在5分鐘內特異性的和活細胞中單鏈狀態的鳥嘌呤反應，被修飾的RNA片段可通過相互作用富集。值得關注的是，N3-kethoxal修飾是可逆的，加熱後即可被去除。
KAS-seq驗證和KAS-seq概述，來源：Nature Methods
研究人員將N3-kethoxal加入細胞培養液，5分鐘後提取富集標記後的DNA片段並建庫測序。結果顯示，KAS-seq信號在基因編碼區顯著富集，且具有較高的靈敏度。當Pol II延伸被抑制時，KAS-seq信號僅出現在啟動子；當Pol II結合被抑制時，該信號在基因編碼區完全消失。此外，
KAS-seq能同時檢測Pol I和Pol lIII介導的轉錄活性，表明該方法可準確檢測全基因組DNA轉錄活性。研究發現，KAS-seq可以定義一組具有獨特序列基序的單鏈增強子。這些增強子與特定的轉錄因子結合有關，並且比典型的增強子表現出更多的增強子-啟動子相互作用。在抑制蛋白質凝結的條件下，該方法可發現從一組啟動子中快速釋放的Pol II。KAS-seq有助於以高通量方式同時快速、準確地分析轉錄動力學和增強子活性，未來或可廣泛運用在轉錄變化的動態檢測中。
低輸入量細胞和小鼠肝臟的KAS-seq檢測結果。來源：Nature Methods
此外，KAS-seq利用1000個細胞產生的數據與使用大量細胞產生的數據相似，可用於低起始量細胞或冷凍動物組織中的ssDNA檢測，甚至有可能用於活體動物上。
總而言之，何川團隊最新開發的KAS-seq方法，是一種簡單、低起始量、高靈敏度的ssDNA測序方法，可同時檢測轉錄活性、增強子活性以及DNA結構變化，適用於稀有樣本的轉錄動態變化檢測。研究團隊表示，隨著技術的優化，KAS-seq有望實現單細胞、甚至單分子層面的ssDNA檢測，成為轉錄以及其他生物過程研究中不可或缺的工具。
Kethoxal-assisted single-stranded DNA sequencing captures global transcription dynamics and enhancer activity in situ. Nature Methods (2020)
https://www.nature.com/articles/s41592-020-0797-9
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