大概在1495年，米蘭公爵斯福爾扎請達·芬奇到聖瑪利亞修道院繪製這幅壁畫。一個與達芬·奇同時代的人班代洛寫道：“我多次看見他大清早爬上架子，繪《最後的晚餐》。他從早到晚總不停手，也不吃不喝。然後三四天不動手繪畫，只是對著畫稿仔細端詳，喃喃自語批評畫中人物。”
有一個也許是杜撰的故事說，畫中猶大的面貌是根據那修道院院長的相貌繪成的，因為院長抱怨達·芬奇畫得太慢，使達·芬奇非常生氣。
奇怪的是猶大的面貌也有點像耶穌，達·芬奇似乎要把這叛徒畫得貌似救世主但猥瑣得可憐。動手繪畫前的難題是怎樣避免壁畫受潮剝落。達·芬奇的創造力不同凡響，他特別調製一種由石膏粉、硬瀝青和乳香樹脂混合而成的封塞料，抹在那石質鬆軟的牆上作底子，然後在上面繪壁畫。
可惜他始創的混合物並無預期的效用，後來畫面的油質顏料開始剝落。早在1517年，畫上顏料脫落的情況已經看得出來，當時是達·芬奇逝世前兩年。
1566年，有一個參觀過壁畫的人說什麼都看不見，只是“一片汙痕”。又過了一個世紀，《最後的晚餐》看來簡直是無可救藥了，有一個修士就索性在壁畫下方的牆上把門擴大，因而耶穌基督的腳也削去了。不過壁畫無論如何不是“一片汙痕”，雖則暗淡些，仍然是曠世的傑作。幾百年來，它經歷多場災劫而留存至今。
比方說在拿破崙時代，軍隊把這飯廳當做堆放馬料的地方。第二次世界大戰時，房頂和壁畫右面的牆都炸壞了。可更糟的是有人進行過幾次胡亂的修復工作，十八世紀初至今一共修了6次，大多數是在原畫上補繪。
到了20世紀中葉，這幅《最後的晚餐》已成為褪色、剝落而滿布汙痕的殘品了。不過1980年以來，這幅壁畫的剝落現象已經停止了，繼而轉入一個緩慢而近乎奇蹟的新生過程。
運用科學方法恢復壁畫本來面目的工作已經開始，整件工作由隆巴第地區美術品總監領導。先極仔細地查看壁畫，然後開始逐次修復非常細小的一塊。現在專家正在剔除以前“修復”造成的破壞，盡最大努力恢復壁畫原來的面貌。
運用解剖刀和溶劑在這逐塊剝落的彩繪壁畫上做修復工作，其細緻與複雜足以使人頭昏眼花。不久之前，負責修復工作的領導人布蘭比拉對一個參觀者說，“看見這小片藍色嗎?”她指著壁畫的白桌布上一小點顏色，解釋說：“這是從別處掉下來的，達·芬奇繪畫時，這片油彩是一個門徒袍子上的顏色。”當然，她的工作是把那片油彩放回原處。
壁畫在這次修復前，是許多不成形狀的碎片拼湊起來的殘缺物，在一些連底層也脫落了的地方，原畫根本無跡可尋。即使如此，這次修復工作也取得極好的成果。
到1982年，靠右邊的四分之一幅壁畫畫面已大致修復完成。西門、達太和馬太眾門徒已經冼脫了幾百年來積聚的塵垢，重現本來面目。
在這過程中，布蘭比拉和她的同事發現了原畫上一些出人意料的地方。比方說達·芬奇繪西門的臉時本來只繪上短短的鬍子，可是幾百年來，修復時在原畫上多次補畫，鬍子加長了很多。
桌上的食品本來是吃了一半的，有一個切開的橘子和掰開的麵包，但是不知道是誰竟不問情由“改正”了這些富於趣味的細節，把麵包繪成完完整整的，橘子也變回完整的一個。畫面別的地方經過這次修復，生命的活力逐步顯現，玻璃杯上又顯出了閃耀的金邊，桌上的銀餐具又反映出聖徒袍子的顏色。
到現在為止，修復工作都是在揭開原畫的真貌。世界上的藝術愛好者都熱切期待這幅傑作重新顯現真面目。到那時，這幅壁畫會再度顯示一位曠世奇才的超凡創造力。
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