本文作者：張琪，李健（北京大學腫瘤醫院暨北京市腫瘤防治研究所 消化腫瘤內科 惡性腫瘤發病機制及轉化研究教育部重點實驗室，北京 100142）
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【摘要】 免疫治療為結直腸癌患者提供了新的選擇，但目前明確的獲益人群僅侷限於微衛星高度不穩定（microsatellite instability-high，MSI-H）患者，且在此類患者中仍然存在療效差異。高腫瘤突變負荷和DNA聚合酶亞基的關鍵編碼基因POLE/POLD1突變是除MSI-H外最具潛力的免疫治療預測指標。結直腸癌中程序性死亡蛋白配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）表達與否與免疫治療療效並無明確關聯。其他如腫瘤新抗原、腸道菌群等生物標誌物也在研究中。結合結直腸癌異質性，聯合多種生物標誌物進行預測或許更具前景。
【關鍵詞】 結直腸癌；免疫治療；預測標誌物
免疫治療，尤其是免疫檢查點抑制劑（immunotherapy checkpoint inhibitor，ICI）為晚期結直腸癌患者帶來了希望，但早期研究顯示免疫治療在非選擇性結直腸癌中效果非常有限[1,2]。儘管後續逐漸發現了微衛星狀態和腫瘤突變負荷（tumor mutation burden，TMB）等預測指標，但真正能獲益的患者仍然有限。考慮免疫治療昂貴的費用和導致的不良反應，探索預測免疫治療效果的標誌物並充分利用至關重要。
1 微衛星狀態
既往研究證實，微衛星狀態是包括結直腸癌在內的泛瘤種免疫治療效果的預測指標[3]。微衛星高度不穩定（microsatellite instability-high，MSI-H）/錯配修復功能缺陷（deficient mismatch repair，dMMR）結直腸癌通常有較高的新抗原負荷[4]，豐富的淋巴結細胞浸潤[5]以及腫瘤微環境中如程序性死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）、程序性死亡蛋白配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）、細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4）上調[6]，可能是免疫治療有效的原因。但在MSI-H/dMMR結直腸癌中，抗PD-1單藥治療效果也存在較大差異[客觀有效率（objective response rate，ORR）為28%～52%，疾病控制率（disease control rate，DCR）為51%～82%][3,7]。2020年美國臨床腫瘤學會胃腸腫瘤研討會（American Society of Clinical Oncology-gastrointestinal cancer，ASCO-GI）公佈了CheckMate-142研究使用納武利尤單抗聯合伊匹單抗的最新數據：雙免疫治療MSI-H/dMMR結直腸癌的ORR為64%。說明MSI-H/dMMR單獨作為免疫療效預測指標仍未滿足臨床需求。
通過免疫組化和聚合酶鏈反應評估腫瘤組織樣本的微衛星狀態已較為成熟。隨著基因檢測技術的發展，二代基因測序（next generation sequencing，NGS）也開始應用於微衛星狀態檢測，並有較高的靈敏度和一致率[8,9]。同時進行微衛星狀態和RAS、RAF等靶向基因檢測可以大大減少組織樣本需求。通過NGS檢測外周血循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）的MSI（MSI from blood ctDNA，bMSI）也進入臨床驗證階段[10]，這為晚期腫瘤患者標本取材困難或不足提供了新的解決辦法，並且顯示出較好的前景。北京大學腫瘤醫院消化腫瘤內科沈琳教授牽頭的bMSI在以消化系統為主的多中心臨床療效驗證隊列研究（IMPACT研究）已進入數據分析階段，結果值得期待。
2 腫瘤突變負荷
TMB已在多個實體瘤中被證實是獨立於MSI狀態和PD-L1表達的ICI療效預測指標[11-13]。目前認為TMB越高，腫瘤免疫原性越強，腫瘤細胞被T細胞識別的概率越大，使用ICI更易引起免疫應答。在結直腸癌中，dMMR腫瘤TMB顯著高於錯配修復功能完整（proficient mismatch repair，pMMR）腫瘤[11]。
由於TMB與MSI存在密切關係，因此，TMB能否作為結直腸癌獨立的療效預測指標目前仍有爭議，且其高低分界閾值尚無定論。一項納入22例經免疫治療的MSI-H的轉移性結直腸癌（metastatic colorectal cancer，mCRC）患者的研究顯示，TMB與ORR和無進展生存（progression free survival，PFS）時間密切相關，高TMB患者（TMB＞41個突變/Mb）疾病均得到控制，且截至數據發表時，患者的中位PFS尚未達到（中位隨訪時間超過18個月），低TMB者（TMB＜37個突變/Mb）DCR僅為33.3%、中位PFS時間僅2個月[7]。CheckMate-142研究顯示，雙免疫治療MSI-H的mCRC患者ORR更高，表明雙免疫治療對TMB的閾值要求或許更低[14]。2019 ASCO-GI公佈的CCTG CO.26研究中使用度伐利尤單抗＋抗CTLA-4雙免疫治療微衛星穩定型（microsatellite stability，MSS）結直腸癌亞組分析發現：高TMB患者（TMB＞28個突變/Mb）雙免疫治療明顯獲益[中位總生存（overall survival，OS）時間：雙免疫治療組5.5個月∶最佳支持治療組3.0個月，P＝0.004][15]，這也進一步說明了TMB可能是獨立於微衛星狀態的ICI療效預測指標。
目前TMB的測量方法有兩種，一種是全外顯子組或全基因組測序對腫瘤基因組中編碼區發生的非同義突變的數量進行定量，是目前TMB檢測的"金標準"；另一種是通過目標靶向測序，根據特定算法計算出TMB。一項包含18 140例結直腸癌患者的隊列分析結果顯示，MSI-H患者（821例）中位TMB為46.1個突變/Mb，MSS患者為3.5個突變/Mb，建議區分高低TMB的最佳閾值定位為37.4 個突變/Mb，
這與前文所述免疫治療效果驗證的小隊列研究結論基本一致[7]，也期待這一大樣本經療效驗證後的結果。目前關於TMB的臨床應用仍存在問題，如檢測技術要求較高、檢測平臺尚缺乏規範、檢測費用昂貴等。
3 POLE/POLD1
DNA聚合酶亞基的關鍵編碼基因POLE和POLD1對於NDA複製的校對和保真發揮重要作用[16]。既往研究顯示，POLE和/或POLD1基因突變發生率約為1%，以年輕、男性、右半結腸癌多見，且突變患者預後較好[17]。與MSI-H腫瘤相似，POLE/POLD1突變與高TMB相關[18,19]，POLE突變的結直腸癌CD8+淋巴細胞浸潤增加，細胞毒性T細胞標誌物和效應細胞因子表達增加，同時編碼免疫檢查點基因（PD-1、PD-L1、CTLA4）上調[20]。
既往有關POLE和POLD1突變結直腸癌患者免疫治療有效僅有個案報道[21]。2019年徐瑞華教授團隊通過公共數據庫檢索了47 721例腫瘤患者並進行分析顯示：結直腸癌POLE和/或POLD1突變頻率為7.37%（197/2674）。在所有接受ICIs治療的實體瘤患者中，突變患者的OS顯著優於野生型患者（34個月∶18個月，P＝0.0038），雖然其中26%的患者合併MSI-H，但去除這部分患者後其生存獲益仍十分顯著（28個月∶16個月），多因素分析也證實POLE和/或POLD1突變可作為預測ICIs治療獲益的獨立指標（P＝0.047）[22]。目前評估POLE突變結直腸癌的ICI研究（NCT03150706，NCT03435107）也正在進行中。
4 程序性死亡蛋白配體-1
腫瘤微環境中PD-L1上調與效應T細胞浸潤增加相關，因而認為PD-L1陽性表達的腫瘤患者更可能從ICI治療中獲益。雖然PD-L1表達在胃癌和肺癌等癌種中被認為是免疫治療的預測指標之一[23]，但目前證據認為其在結直腸癌中並無預測價值。KEYNOTE-028亞組分析中，接受帕博利珠單抗治療的23例PD-L1陽性結直腸癌患者中僅1例達到部分緩解（partial response，PR）（ORR為4%），且該例患者為MSI-H/dMMR[24]。KEYNOTE-016研究顯示，帕博利珠單抗治療mCRC的PFS和OS與PD-L1表達無關[25]。CheckMate-142研究顯示，納武利尤單抗單藥或聯合伊匹單抗治療mCRC，證實其ORR與PD-L1表達無關[14]。PD-L1作為細胞表面蛋白，其表達與否與局部腫瘤微環境內的相互作用有關，呈動態變化，這可能是PD-L1表達狀態與抗PD-1/PD-L1治療效果不一致的原因之一[26]。此外，檢測試劑的差異和陽性閾值的界定也可能影響PD-L1表達的預測價值[26]。
5 其他生物標誌物
5.1 新抗原負荷 MSI-H和高TMB對免疫治療有反應的機制均被認為與產生了更多的新抗原相關[27]。新抗原負荷，即由T細胞靶向的腫瘤特異性突變數目，理論上是一項更直接、更強效的預測指標。通常新抗原的計算基於錨定在主要組織相容性複合體（major histocompatibility complex，MHC）上的殘基肽來預測，但研究證實該方法所得結果並不優於TMB[28]。預測新抗原的其他工具和模型正處於研究階段，如通過評估突變型和野生型肽產生的MHC結合位點的半抑制濃度差異識別新抗原的抗原表位識別力差異指數（differential agretopicity index，DAI）[29]、包含腫瘤克隆以及DAI和免疫微生物表位的同源序列三種要素的評分矯正模型[30]等。隨著基因測序技術的發展和大數據分析能力的提高，尤其對於MSI-H佔比較高的結直腸癌，腫瘤新抗原定會成為預測免疫治療效果的重要標誌物之一。
5.2 腸道菌群 腸道菌群對免疫治療的影響正在如火如荼地研究中。自2018年，研究相繼發現，無法從免疫治療獲益的肺癌和腎癌患者體內缺乏Akermansia Muciniphila細菌，並通過糞便移植的小鼠證實了這一菌群對抗PD-1治療的影響[31]。後續關於黑色素瘤患者免疫治療的研究進一步證實了腸道菌群對免疫治療的作用[31,32]。而在結直腸癌演變中發揮基礎作用的腸道菌群有望成為預測免疫治療效果的重要指標[33]。
5.3 腫瘤浸潤淋巴細胞 ICI治療機制是通過增強體內已經存在的免疫反應發揮抗腫瘤作用[34]，因此，腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）被認為是極具潛力的療效預測標誌物。其中，基於腫瘤中心和侵襲邊緣中CD3+和CD8+T細胞密度確定的免疫評分，被證實可預測Ⅰ～Ⅲ期結腸癌患者預後[35]，甚至優於TMN分期。免疫評分作為直接反映腫瘤內部免疫狀態的指標，也有望成為免疫治療效果的預測指標，一項在高免疫評分的mCRC患者中評價化療聯合帕博利珠單抗療效的研究即將開展（POCHI研究）。
5.4 炎性T細胞基因表達譜 T細胞分泌的γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）是PD-L1表達的關鍵驅動因子。一項研究通過RNA測序篩選出與IFN-γ相關的mRNA，形成由18個基因組成的基因組合，以此對
炎性T細胞基因表達譜（gene expression profile，GEP）進行分析，結果顯示T細胞GEP可以作為經帕博利珠單抗治療且包含結直腸癌在內的9個瘤種的療效預測指標[36]。後續一項彙總四項KEYNOTE研究（包含結直腸癌共22種、300例樣本）也證實了上述結論，且炎性T細胞GEP聯合TMB可進一步提升預測價值，其中高TMB、高GEP患者免疫反應最強。該結論得到來自TCGA數據庫的6384例樣本驗證[12]。但研究採用的mRNA檢測，目前在國內檢測平臺比較少見，其費用相對昂貴，應用於臨床尚需時日，且該標誌物尚需結直腸癌大樣本隊列進一步驗證。
5.5 其他免疫相關指標 編碼β2微球蛋白的B2M基因截短突變可以導致MHC-Ⅰ抗原呈遞受損，引起免疫逃避，雖然研究表明有B2M突變的MSI-H結直腸癌預後更好[37]，但存在該突變的腫瘤可能對帕博利珠單抗反應較差[3]。一項研究通過對接受帕博利珠單抗治療的結腸癌和黑色素瘤樣本分析顯示：JAK1/2基因突變通過導致癌細胞PD-L1表達下調，使免疫治療耐藥[38]。此外，黑色素瘤和非小細胞肺癌中LRP1B基因突變[39]、黑色素瘤中SERPINB3和SERPINB4基因突變[40]、腎細胞癌中PBRM1基因失活突變[41]可能是免疫治療反應的正向預測指標；而非小細胞肺癌中STK11/LKB1突變、黑色素瘤和子宮平滑肌瘤中PTEN基因失活突變[42,43]是免疫治療的負向預測指標；但上述指標對結直腸癌的免疫治療是否有預測作用尚需大樣本隊列研究驗證。
結直腸癌是一類異質性極強的瘤種，單一的生物標誌物均難以準確預測免疫治療效果，聯合多種指標，如MSI-H/TMB[7]、TMB/炎性T細胞GEP[12]，抑或納入多項指標的預測模型更加具有前景。
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